生物大分子的制备2蛋白质酶的分离纯化ppt课件

1、1 生物大分子的制备生物大分子的制备2 蛋白质酶的分别纯化蛋白质酶的分别纯化第四章第四章 样品的全息制备样品的全息制备1 生物大分子的制备生物大分子的制备1.1 概述概述1.2 生物大分子制备的前处置生物大分子制备的前处置1.3 生物大分子的分别纯化生物大分子的分别纯化1.4 样品的保管样品的保管1.1 概述概述在生命科学高度开展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的构造与功在生命科学高度开展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的构造与功能的研讨是探求生命奥妙的中心课题，而生物大分子构造与功能的研讨，必需能的研讨是探求生命奥妙的中心课题，而生物大分子构造与功能的研讨，必需首先处理生物大分子的制

2、备问题，假设没有可以到达足够纯度的生物大分子的首先处理生物大分子的制备问题，假设没有可以到达足够纯度的生物大分子的制备任务为前提，构造与功能的研讨就无从谈起。然而生物大分子的分别纯化制备任务为前提，构造与功能的研讨就无从谈起。然而生物大分子的分别纯化与制备是一件非常细致而困难的任务。与制备是一件非常细致而困难的任务。 生物资料的组成极其复杂，经常包含有数百生物资料的组成极其复杂，经常包含有数百种乃至几千种化合物。种乃至几千种化合物。 许多生物大分子在生物资料中的含量极微，许多生物大分子在生物资料中的含量极微，分别纯化的步骤繁多、流程长。分别纯化的步骤繁多、流程长。 许多生物大分子一旦分开了生物

3、体内的环境许多生物大分子一旦分开了生物体内的环境时就极易失活，因此分别过程中如何防止其失时就极易失活，因此分别过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进展的，生物大分子的制备几乎都是在溶液中进展的，温度、温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判别。各种组成的综合影响，很难准确估计和判别。 生物大分子中的各种详细物质的组成比例不生物大分子中的各种详细物质的组成比例不同。同。与化学产品的分别制备相比较，生物大分子与化学产品的分别制备相比较，生物大

4、分子的制备有以下主要特点：的制备有以下主要特点：生物大分子的制备通常可按以下步骤进展：生物大分子的制备通常可按以下步骤进展： 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进展科研、开发还确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进展科研、开发还是要发现新的物质。是要发现新的物质。 建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 经过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理经过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。化学性质。 生物资料的破碎和预处置。生物资料的破碎和预处置。 分别纯化方案的选择和探求，这是最困

5、难的过程。分别纯化方案的选择和探求，这是最困难的过程。 生物大分子制备物的均一性即纯度的鉴定，要求到达一维生物大分子制备物的均一性即纯度的鉴定，要求到达一维电泳一条带，二维电泳一个点，或电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一和毛细管电泳都是一个峰。个峰。 产物的浓缩、枯燥和保管。产物的浓缩、枯燥和保管。分析测定的方法主要有两类：分析测定的方法主要有两类：即生物学和物理、化学的测定方法。即生物学和物理、化学的测定方法。生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性

6、同位素示踪法等；放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法液相色谱法、光谱法 (紫外紫外/可见、红外和可见、红外和荧光等分光光度法荧光等分光光度法)、电泳法、以及核磁共、电泳法、以及核磁共振等。振等。实践操作中尽能够多用仪器分析方法，以使分实践操作中尽能够多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。析测定更加快速、简便。要了解生物大分子的物理、化学性质主要有：要了解生物大分子的物理、化学性质主要有： 在水和各种有机溶剂中的溶解性。在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大值和

7、各种缓冲液中生物大分子的稳定性。分子的稳定性。 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 各种物理性质：如分子大小、穿膜才干、带各种物理性质：如分子大小、穿膜才干、带电情况、在电场中的行为、离心沉降时的表电情况、在电场中的行为、离心沉降时的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力。对其他生物分子的特殊亲和力。生物大分子的分别纯化方法多种多样，主要生物

8、大分子的分别纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差别，如分子的大小、是利用它们之间特异性的差别，如分子的大小、外形、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和外形、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。与其他分子的亲和性等。各种方法的根本原理可以归纳为两个方面：各种方法的根本原理可以归纳为两个方面：利用混合物中几个组分分配系数的差别，把它利用混合物中几个组分分配系数的差别，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；剂沉淀、层析和结晶等；将混合物置于某一物相大多数是液相中，将混合物置于某一物相大多数是液相中，经过物

9、理力场的作用，使各组分分配于不同经过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而到达分别的目的，如电泳、离的区域，从而到达分别的目的，如电泳、离心、超滤等。心、超滤等。目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。电泳、层析和高速与超速离心。1.2 生物大分子制备的前处置生物大分子制备的前处置1.2.1 生物资料的选择生物资料的选择制备生物大分子，首先要选择适当的生物资料。资料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。选择的资料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、本钱低，尽能够坚持新颖，尽快加工处置。动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非

10、活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，假设所要求的成分在细胞内，那么要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物资料要及时将菌体与发酵液分开。生物资料如暂不提取，应冰冻保管。动物资料那么需深度冷冻保管。1.2.2 细胞的破碎细胞的破碎不同的生物体或同终身物体的不同部位的组织，不同的生物体或同终身物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，运用的方法也不一样，如其细胞破碎的难易不一，运用的方法也不一样，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较巩固的纤维素、半纤维素组成的细胞物由于具有较巩固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎

11、方法。壁，要采取专门的细胞破碎方法。(1) 机械法：机械法： 研磨：将剪碎的动物组织或其它生物资料置于研研磨：将剪碎的动物组织或其它生物资料置于研钵或匀浆器中，参与少量石英砂研磨成匀浆。钵或匀浆器中，参与少量石英砂研磨成匀浆。 组织捣碎器：这是一种较猛烈的细胞破碎方法，组织捣碎器：这是一种较猛烈的细胞破碎方法，通常可先用家用食品加工机械将组织打碎，然后通常可先用家用食品加工机械将组织打碎，然后再用再用1000020000r/min的内刀式组织捣碎机即的内刀式组织捣碎机即高速分散器将组织的细胞打碎。高速分散器将组织的细胞打碎。(2) 物理法：物理法：反复冻融法：将待破碎的细胞冷至反复冻融法：将待

12、破碎的细胞冷至-15到到-20，然，然后放于室温或后放于室温或40迅速融化，如此反复冻融多次，迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内构成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起由于细胞内构成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。细胞溶胀破碎。超声波处置法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞超声波处置法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。一些。压榨法：这是一种温暖的、彻底破碎细胞的方法。在压榨法：这是一种温暖的、彻底破碎细胞的方法。在1000105 Pa2000105 Pa 的高压下使细胞悬液经的高压下

13、使细胞悬液经过一个小孔忽然释放至常压，细胞将彻底破碎。过一个小孔忽然释放至常压，细胞将彻底破碎。冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在用此法。在90左右维持数分钟，立刻放入冰浴中使左右维持数分钟，立刻放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。(3) 化学与生物化学方法：化学与生物化学方法：自溶法：将新颖的生物资料存放于一定的自溶法：将新颖的生物资料存放于一定的 pH 和适当和适当的温度下，细胞构造在本身所具有的各种水解酶如的温度下，细胞构造在本身所具有的各种水解酶如蛋白

14、酶和酯酶等的作用下发生溶解，使细胞内含物蛋白酶和酯酶等的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。释放出来。溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在浸透压差，溶剂分子大量度的稀盐溶液中，由于存在浸透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于牛酶和酯酶等，于37，pH8，处置，处置15分钟，可以专分钟，可以专注性地将细胞壁分解。注性地将细胞壁分解。 有机溶剂处置法

15、：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶有机溶剂处置法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或剂或 SDS十二烷基磺酸钠等外表活性剂处置细胞，十二烷基磺酸钠等外表活性剂处置细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法结合运用。磨法结合运用。1.2.3 生物大分子的提取生物大分子的提取“提取是在分别纯化之前将经过预处置或破碎的细胞置提取是在分别纯化之前将经过预处置或破碎的细胞置于溶剂中，使被分别的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽于溶剂中，使被分别的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽能够坚持原来的天然形状不丧失生物活性的过程。能够坚持原来的天然形状不

16、丧失生物活性的过程。 通常：通常：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大；温度升高，溶解度加大；远离等电点的远离等电点的pH值，溶解度添加。值，溶解度添加。影响提取的要素主要有：影响提取的要素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相分散到液相的难易；由固相分散到液相的难易；溶剂的溶剂的pH值和提取时间等。值和提取时间等。留意：提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的添

17、加和留意：提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的添加和坚持其生物活性。坚持其生物活性。蛋白质和酶的提取普通以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液蛋白质和酶的提取普通以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应留意的几个主要影响要素是：溶剂。用水溶液提取生物大分子应留意的几个主要影响要素是：1) 盐浓度盐浓度 (即离子强度即离子强度)：离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶

18、解度添加。蛋白复合物，在高离子强度下溶解度添加。绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中参与少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯溶解度，如在纯水中参与少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大添加，称为水时大大添加，称为“盐溶景象。盐溶景象的产生主要是少量盐溶景象。盐溶景象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，添离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，添加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。为了提高提取效率，有时需求降低或提高溶剂的极性。向为了

19、提高提取效率，有时需求降低或提高溶剂的极性。向水溶液中参与蔗糖或甘油可使其极性降低，添加离子强度水溶液中参与蔗糖或甘油可使其极性降低，添加离子强度(如参如参与与KCl、NaCl、NH4Cl或或(NH4)2SO4)，可以添加溶液的极性。，可以添加溶液的极性。 水溶液提取：水溶液提取： 2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过值有关。过酸、过碱均应尽量防止，普通控制在酸、过碱均应尽量防止，普通控制在pH=68范围内，提取溶范围内，提取溶剂的剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点

20、的两侧。的两侧。 3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时普通在时普通在05的低温操作。的低温操作。 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：参与抑制剂或调理提取液防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：参与抑制剂或调理提取液的的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物溶解，普通采用温暖搅拌搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物溶解，普通采用温暖搅拌为宜，速

21、度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。由于普通蛋白质都含有相当数量会引起酶等物质的变性失活。由于普通蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基经常是活性部位的必需基团，假设提取液中的巯基，有些巯基经常是活性部位的必需基团，假设提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中参与少量或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中参与少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。

22、一些和脂类结合比较结实或分子中非极性侧链较一些和脂类结合比较结实或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。水性和亲脂性。有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在

23、这种情况下，采用稀的有机溶液提取经常可以防止水解酶的破坏，采用稀的有机溶液提取经常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用，如胰岛素的提并兼有除去杂质提高纯化效果的作用，如胰岛素的提取即是如此。取即是如此。 有机溶剂提取有机溶剂提取由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不能够有一上万种生物分子又处于同一体系中，因此不能够有一个适宜于各类分子的固定的分别程序，但多数分别任个适宜于各类分子的固定的分别程序，但多数分别任务关键部分的根本手段是一样的。务关键部分的根本手段是一样的。为了防止盲目性，节省实验探

24、求时间，要仔细参为了防止盲目性，节省实验探求时间，要仔细参考和自创前人的阅历，少走弯路。考和自创前人的阅历，少走弯路。常用的分别纯化方法和技术有：沉淀法包括：常用的分别纯化方法和技术有：沉淀法包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等、离心、吸附盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。1.3 生物大分子的分别纯化生物大分子的分别纯化沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相而析出的过沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相而析出的过程。沉淀法

25、即溶解度法操作简便，本钱低廉，不程。沉淀法即溶解度法操作简便，本钱低廉，不仅适用于实验室中，也可用于某些消费目的的制备过仅适用于实验室中，也可用于某些消费目的的制备过程，是分别纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶程，是分别纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。经过沉淀，将目的生物大分子转入时最常用的方法。经过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分别。固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分别。 沉淀法沉淀法 的根本原理是根据不同物质在溶剂中的的根本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而到达分别的目的，不同溶解度的产生是溶解度不同而到达分别的目的，不同

26、溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差别而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质别而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及构造有关，溶剂组分的改动或参与某些沉淀剂以及及构造有关，溶剂组分的改动或参与某些沉淀剂以及改动溶液的改动溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改动。解度产生明显的改动。1.3.1 沉淀法沉淀法中性盐沉淀盐析法：多用于各种蛋白质和酶的中性盐沉淀盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分别纯化。分别纯化。有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以有机溶剂沉淀：

27、多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分别纯化。及生物小分子的分别纯化。选择性沉淀热变性沉淀和酸碱变性沉淀：多用选择性沉淀热变性沉淀和酸碱变性沉淀：多用于除去某些不耐热的和在一定于除去某些不耐热的和在一定 pH 值下易变性的杂蛋值下易变性的杂蛋白。白。等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独运用较少，多与其他方法结合的沉淀，但此法单独运用较少，多与其他方法结合运用。运用。有机聚合物沉淀：是开展较快的一种新方法，有机聚合物沉淀：是开展较快的一种新方法， 主要主要运用聚乙二醇运用聚乙二醇(Polyethyene glycol,

28、 PEG)作为沉淀剂。作为沉淀剂。在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：在溶液中参与中性盐使生物大分子沉淀析在溶液中参与中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为出的过程称为“盐析。除了蛋白质和酶以外，盐析。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进展沉淀多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进展沉淀分别。分别。盐析法运用最广的还是在蛋白质领域，已盐析法运用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：有八十多年的历史，其突出的优点是： 本钱低，不需求特别昂贵的设备。本钱低，不需求特别昂贵的设备。 操作简单、平安。操作简单、平安。 对

29、许多生物活性物质具有稳定作用。对许多生物活性物质具有稳定作用。1.3.1.1 中性盐沉淀盐析法中性盐沉淀盐析法蛋白质和酶均易溶于水，由于该分子的蛋白质和酶均易溶于水，由于该分子的 -COOH、 -NH2 和和 -OH 都是亲水基团，这些基团与极性水分子都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用构成水化层，包围于蛋白质分子周围构成相互作用构成水化层，包围于蛋白质分子周围构成1100nm颗粒的亲水胶体，减弱了蛋白质分子之间的作颗粒的亲水胶体，减弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子外表极性基团越多，水化层越厚，用力，蛋白质分子外表极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因此

30、溶解蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因此溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定要素有两个：即电度也越大。亲水胶体在水中的稳定要素有两个：即电荷和水膜。由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子荷和水膜。由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以参与大量中性盐后，夺走了水分子，的亲水性，所以参与大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴显露疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了水膜，暴显露疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即构成沉淀。盐析表示破坏了亲水胶体，蛋白质分子即构成沉淀。盐析表示图如下页图如下页“图图 所示。所示。 中性盐沉淀蛋白质的根本原理中性盐沉淀蛋白质的根本原理

31、盐析原理表示图盐析原理表示图常用的中性盐中最重要的是常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，由于它与其他常用，由于它与其他常用盐类相比有非常突出的优点：盐类相比有非常突出的优点： 中性盐的选择中性盐的选择1)溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因此盐析操作也要求在低温下因此盐析操作也要求在低温下(04)进展。由下表可以看到，进展。由下表可以看到，硫铵在硫铵在0时的溶解度，远远高于其它盐类：时的溶解度，远远高于其它盐类

32、： 几种盐在不同温度下的溶解度几种盐在不同温度下的溶解度 (g/100ml水水) 0 20 80 100 (NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 1012)分别效果好：有的提取液参与适量硫酸铵盐析，一步就可以分别效果好：有的提取液参与适量硫酸铵盐析，一步就可以除去除去75的杂蛋白，纯度提高了的杂蛋白，纯度提高了4倍。倍。3)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质构造的作用有的酶或蛋不易引起变性，有稳定酶与蛋白质构造的作用有的酶或蛋白质用白质用23mol/L浓度的浓度的(NH4)2SO4保管可

33、达数年之久。保管可达数年之久。4)价钱廉价，废液不污染环境。价钱廉价，废液不污染环境。最常用的是固体硫酸铵参与法。将其研最常用的是固体硫酸铵参与法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地参与，成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地参与，接近方案饱和度时，加盐的速度更要慢一些，接近方案饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量防止部分硫酸铵浓度过大而呵斥不应有尽量防止部分硫酸铵浓度过大而呵斥不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分别，在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分别

34、，高浓度硫酸铵常用过滤方法。高浓度硫酸铵常用过滤方法。 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。录中查出。 盐析的操作方法盐析的操作方法 盐析曲线的制造盐析曲线的制造 假设要分别一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以假设要分别一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以自创，那么应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。自创，那么应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 蛋白质量蛋白质量(mg)或酶活力或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱和度硫铵饱和度1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低

35、的硫酸铵饱和度沉淀，假设蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白和度沉淀，假设蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.53.0，相当于相当于2530mg/mL。2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，pH值值常选在该蛋白质的等电点附近。常选在该蛋白质的等电点附近。3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反在高离子

36、强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而添加的。普通情况下，度大多数还是随浓度升高而添加的。普通情况下，可在室温下进展。但对于某些对温度敏感的酶，要可在室温下进展。但对于某些对温度敏感的酶，要求在求在04下操作，以防止活力丧失。下操作，以防止活力丧失。 盐析的影响要素盐析的影响要素1.3.1.2 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法根本原理：根本原理：有机溶剂对于许多蛋白质有机溶剂对于许多蛋白质 (酶酶)、核酸、多糖和小、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早运用的沉淀分子生化物质都

37、能发生沉淀作用，是较早运用的沉淀方法之一。其原理主要是：方法之一。其原理主要是：降低水溶液的介电常数，向溶液中参与有机溶剂能降低水溶液的介电常数，向溶液中参与有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而减弱降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而减弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。白质溶解度降低而沉淀。由于运用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的由于运用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因此发生沉淀

38、作用。破坏了蛋白质分子的水膜，因此发生沉淀作用。有机溶剂沉淀法的优缺陷：有机溶剂沉淀法的优缺陷：优点：优点：分辨才干比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比分辨才干比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易如有必要，可用透析袋脱有沉淀不用脱盐，过滤比较容易如有必要，可用透析袋脱有机溶剂。因此在生化制备中有广泛的运用。机溶剂。因此在生化制备中有广泛的运用。缺陷：缺陷：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进展。低温下进展。有机溶剂的选

39、择和浓度的计算有机溶剂的选择和浓度的计算 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。为了获得沉淀沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。为了获得沉淀而不着重于进展分别，可用溶液体积的倍数：如参与一倍、而不着重于进展分别，可用溶液体积的倍数：如参与一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进展有机溶剂沉淀。二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进展有机溶剂沉淀。温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高

40、就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反响，因此必需预冷，操作要在冰盐浴中热反响，因此必需预冷，操作要在冰盐浴中进展，参与有机溶剂时必需缓慢且不断搅拌进展，参与有机溶剂时必需缓慢且不断搅拌以免部分过浓。普通规律是温度越低，得到以免部分过浓。普通规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。的蛋白质活性越高。样品浓度：低浓度样品回收率低，要运用比样品浓度：低浓度样品回收率低，要运用比例更大的有机溶剂进展沉淀。高浓度样品，例更大的有机溶剂进展沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。通常运用蛋

41、白的共沉淀作用大。通常运用520mg/mL的蛋白质初浓度为宜。的蛋白质初浓度为宜。有机溶剂沉淀的影响要素：有机溶剂沉淀的影响要素：pH值：选择在样品稳定的值：选择在样品稳定的pH值范围内，通常值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨才干。辨才干。离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超越通常盐浓度以不超越5为宜，运用乙醇的量为宜，运用乙醇的量也以不超越原蛋白质水溶液的倍体积为宜，也以不超越原蛋白质水溶液的倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白量变性有良好的维护作用，少量的中性盐对蛋白量变性有良好

42、的维护作用，但盐浓度过高会添加蛋白质在水中的溶解度，但盐浓度过高会添加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。淀蛋白质。 沉淀所得的固体样品，假设不立刻溶解进沉淀所得的固体样品，假设不立刻溶解进展下一步分别，那么应尽能够抽干沉淀，减少展下一步分别，那么应尽能够抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如假设必要可以装透析其中有机溶剂的含量，如假设必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。1.3.1.3 选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子

43、这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差别，选择一定的条件使杂在物理化学性质等方面的差别，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分别提纯。蛋白等非目的物变性沉淀而得到分别提纯。热变性热变性 利用生物大分子的热稳定性差别，加热升高温度利用生物大分子的热稳定性差别，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保管目的物在溶液中。使非目的生物大分子变性沉淀而保管目的物在溶液中。外表活性剂和有机溶剂变性外表活性剂和有机溶剂变性使那些对外表活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋使那些对外表活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进展。白变性沉淀。通常在冰浴或冷室

44、中进展。选择性酸碱变性选择性酸碱变性 利用对利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分别纯化流程中附带进展的分别纯化步骤。通常是在分别纯化流程中附带进展的分别纯化步骤。利器具有不同等电点的两性电解质，在到达利器具有不同等电点的两性电解质，在到达电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分别的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性别的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进展初步的沉淀分别。电解质，可以利用此法进展初步的沉淀分别。由于许多蛋白质的等电点非常接近，而且带由于许多蛋白质的等电点非

45、常接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独运用此法分辨率不能完全沉淀析出，因此，单独运用此法分辨率较低，因此此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或较低，因此此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一同配合运用，以提高沉淀才干和分其他沉淀剂一同配合运用，以提高沉淀才干和分别效果。别效果。此法主要用于在分别纯化流程中去除杂蛋白，此法主要用于在分别纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。而不用于沉淀目的物。1.3.1.4 等电点沉淀法等电点沉淀法1.3.1.5 有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法有机聚合物是六十年代开

46、展起来的一类重要的沉有机聚合物是六十年代开展起来的一类重要的沉淀剂，最早运用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和淀剂，最早运用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中运用最病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中运用最多的是多的是“聚乙二醇【聚乙二醇【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n4)】(Polyethylene Glycol，简写为，简写为PEG)，它的亲，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量

47、为子量为600020000的的 PEG。本方法的优点是：本方法的优点是：操作条件温暖，不易引起生物大分子变性。操作条件温暖，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，运用很少量的沉淀效能高，运用很少量的PEG即可以沉淀相当多即可以沉淀相当多的生物大分子。的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。沉淀后有机聚合物容易去除。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析技剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析技术。术。透析只需求运用公用的半透膜即可完成。保管在透透析只需求运用公用的半透膜即可完成。保管在透析袋内

48、未透析出的样品液称为析袋内未透析出的样品液称为“保管液，袋膜外保管液，袋膜外的溶液称为的溶液称为“渗出液或渗出液或“透析液。截留分子量透析液。截留分子量 (MwCO) 通常为通常为10KD左右。左右。用用 1 BaCl2 检查检查 (NH4)2SO4，用，用1AgNO3 检检查查NaCl、KCl等。等。1.3.2 透析透析超越滤即超滤，是一种加压膜分别技术，超越滤即超滤，是一种加压膜分别技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到透过

49、，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。了部分的纯化。超滤可广泛用于含有各种小分子溶质的各超滤可广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子如蛋白质、酶、核酸等的浓种生物大分子如蛋白质、酶、核酸等的浓缩、分别和纯化。缩、分别和纯化。1.3.3 超滤超滤超滤任务原理表示图超滤任务原理表示图受压的生物大分子和小分子溶液浓缩的生物大分子小分子溶液根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径，根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径，可将超滤分为微孔过滤、超滤和反浸透三种。可将超滤分为微孔过滤、超滤和反浸透三种。微孔过滤所用的操作压通常小于微孔过滤所用的操作压通常小于4104Pa，膜的平均孔径为膜的平均孔

50、径为500埃埃14微米微米1微米微米104埃，用于分别较大的微粒、细菌和污染物等。埃，用于分别较大的微粒、细菌和污染物等。超滤所用操作压为超滤所用操作压为4104 7105Pa，膜，膜的平均孔径为的平均孔径为10-100埃，用于分别大分子溶质。埃，用于分别大分子溶质。反浸透所用的操作压力比超滤更大，常到达反浸透所用的操作压力比超滤更大，常到达35105140105Pa，膜的平均孔径最小，普，膜的平均孔径最小，普通为通为10埃以下，用于分别小分子溶质，如海水脱埃以下，用于分别小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。盐，制高纯水等。超滤技术的优点是操作简便，本钱低廉，超滤技术的优点是操作简便，本钱低廉

51、，不需添加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实不需添加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温暖，与蒸发、冰冻枯燥相比没有相的验条件温暖，与蒸发、冰冻枯燥相比没有相的变化，而且不引起温度、变化，而且不引起温度、pH的变化，因此可的变化，因此可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。以防止生物大分子的变性、失活和自溶。在生物大分子的制备技术中，超滤主要用在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。超滤法也有一定的局限性，它不能直接得超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，普通只能得到到干粉制剂。对于蛋白质溶液，普通只能得

52、到1050的浓度。的浓度。超滤技术的关键是膜。超滤技术的关键是膜。 常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来开展了非纤维型的各向异性膜，混合物制成。近年来开展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH1-14都是稳定的，且能在都是稳定的，且能在90下正常任务。超滤下正常任务。超滤膜通常是比较稳定的，能延续用膜通常是比较稳定的，能延续用12年。年。超滤膜的根本性能目的：水通量超滤膜的根本性能目的：水通量 (cm3/(cm2h)；截；截留率留率(以百分率表示以百分

53、率表示)；化学物理稳定性；化学物理稳定性(包括机械强包括机械强度度)等。等。超滤安装由假设干超滤组件构成。分为板框式、管式、超滤安装由假设干超滤组件构成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。 由于超滤法处置的液体多数是含有水溶性生物由于超滤法处置的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和堆积于膜外表上，呵斥严重的浓差极化和堵塞，粘附和堆积于膜外表上，呵斥严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要抑制浓差极化，通常可这是超滤法最关键的问题，要抑制浓差极化，通常

54、可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。冰冻枯燥机是生化与分子生物学实验室必备冰冻枯燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，由于大多数生物大分子分别纯化后的仪器之一，由于大多数生物大分子分别纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的方法就是冰冻枯燥，由于生物大体产品，最好的方法就是冰冻枯燥，由于生物大分子容易失活，通常不能运用加热蒸发浓缩的方分子容易失活，通常不能运用加热蒸发浓缩的方法。法。冰冻枯燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，冰冻枯燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温暖高真空下使冰升华，留下

55、固体干粉。然后在低温暖高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻枯燥的原理可用溶剂的三相点相图来阐明，冰冻枯燥的原理可用溶剂的三相点相图来阐明，见以下图：见以下图：1.3.4 冰冻枯燥冰冻枯燥三相点相图三相点相图当温度在三相点当温度在三相点O以下，将压力降至以下，将压力降至OC线线以下，溶剂通常是水就可以由固相直接升以下，溶剂通常是水就可以由固相直接升华为汽相。华为汽相。冰：冰：-40 上方蒸汽压为上方蒸汽压为0.1mmHg， -60 上方的蒸汽压为上方的蒸汽压为0.01mmHg。1克克0的冰变成的冰变成0的蒸汽需吸热的蒸汽需吸热580千卡，千卡，容器外壁上会挂霜。容器外壁上会挂霜。突出的优点：突出

56、的优点： 样品不起泡，不暴沸。样品不起泡，不暴沸。 得到的干粉样品不粘壁，易取出。得到的干粉样品不粘壁，易取出。 冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。 样品要溶于水，不含有机溶剂，否那么冰点样品要溶于水，不含有机溶剂，否那么冰点降低，样品易融化，起大量泡沫，使样品变降低，样品易融化，起大量泡沫，使样品变性，污染真空泵油。性，污染真空泵油。 样品要予先脱盐，否那么冰冻后易融化。样品要予先脱盐，否那么冰冻后易融化。 样品缓冲液在冰冻时样品缓冲液在冰冻时pH能够会有较大变化，能够会有较大变化，需参与需参与pH稳定剂，如糖类和钙离子等。稳定剂，如糖类和钙离子等。 样

57、品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于度不低于15 mg/mL 为宜。为宜。1.3.4.1 适于冰冻枯燥的样品溶液：适于冰冻枯燥的样品溶液： 用各种尺寸的培育皿盛样品溶液，液层不要用各种尺寸的培育皿盛样品溶液，液层不要太厚，可以运用安瓿瓶和青霉素小瓶。用烧太厚，可以运用安瓿瓶和青霉素小瓶。用烧杯时液层厚度不要超越杯时液层厚度不要超越2 cm2 cm。 冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和呵斥污染，因此要用刺了容易飞散而损失和呵斥污染，因此要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过孔的薄膜

58、或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过小过少，否那么会影响冻干速度。小过少，否那么会影响冻干速度。 1.3.4.2 装样品溶液的冰冻枯燥容器：装样品溶液的冰冻枯燥容器： 溶液冰冻：溶液冰冻：可用干冰可用干冰-乙醇低温浴速冻，边冻边旋转形乙醇低温浴速冻，边冻边旋转形成很薄的冰冻层，可以大大加快冻干的速度。成很薄的冰冻层，可以大大加快冻干的速度。 样品全部冻干前，不要随便摇动，以防水样品全部冻干前，不要随便摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。蒸汽冲散冻干的样品粉末。 假设外霜消逝，那么阐明样品已冻干，或假设外霜消逝，那么阐明样品已冻干，或是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延伸冻是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延

59、伸冻干时间即可。干时间即可。 冻干后要及时取出样品，以免样品在室温冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下停留时间过长而失活。下停留时间过长而失活。 停真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放停真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。 样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。 真空泵要经常检查油面和油色，油面过低真空泵要经常检查油面和油色，油面过低和油色发黑，那么需换油。和油色发黑，那么需换油。 冻干：冻干：1.3.5 分别纯化方法的选择分别纯化方法的选择制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：制备生物大分子

60、的方法可以粗略地分类如下： 以分子大小和形状差别为根据的方法：差以分子大小和形状差别为根据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。滤等。 以溶解度差别为根据的方法：盐析、萃取、以溶解度差别为根据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。分配层析、选择性沉淀和结晶等。 以电荷差别为根据的方法：电泳、电渗析、以电荷差别为根据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。 以生物学功能专注性为根据的方法：亲和以生物学功能专注性为根据的方法：亲和层析等。层析等。1.3.5.1 样品的早期分别纯化