酸奶中优势微生物的分离及乳酸菌饮料的制作

1、酸奶中优势微生物的分离及乳酸菌饮料的制作滕小艳生命科学学院生物科学专业2006级1班 指导老师：宋波摘要：为了解我们日常饮用的酸奶中益生菌的基本情况，本次实验通过酸奶的制作，菌种的活化，传代，分离鉴定和平板划线等方法，对其中的2种菌进行镜检和革兰氏染色以确定其类型，；然后用1种或2种等量混合的方法，发酵制成的产品，比较其发酵性能。结论：在琼脂培养基上，圆形稍扁平的黄色菌落，及其周围培养基变为黄色者，即为乳酸菌。乳酸菌根据细胞为球状或杆状，可分为两大类，即为乳酸链球菌和乳酸杆菌族。嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵的酸奶风味明显优于嗜酸乳杆菌单独发酵。凝乳时间也大为缩短。关键字：保加利亚乳杆菌 嗜酸

2、乳杆菌 嗜热链球菌 革兰氏染色 混合发酵Yogurt microorganisms and lactobacillus drink productionTengXiaoYanLife science college of biological science class 1 grade 2006 ，instructor: song boAbstract: in order to understand our everyday drinkable probiotic yogurt, the basic condition of this experiment through, yogurt, s

3、trains of activation, separation and identification of flat nestin crossed, the method of the two kinds of bacteria for grams staining and to determine the types. Then use one or two equal mixing method, fermented product, compares the performance of fermentation.Conclusion: in AGAR medium, circular

4、 slightly flat yellow, and its surrounding medium colony, to become yellow lactobacillus. According to the cells to aspen, globular or can be divided into two categories, namely, streptococcus and lactobacillus to lactic acid. Acidophilus andKey words：Bulgaria lactobacillus acidophilus streptococcus

5、 thermophilus cultured mixed fermentation grams staining.嗜酸乳杆菌存在于人类和一些动物的小肠内，它在代谢过程中产生能产生乳酸过氧化氢乳酸杀菌素和类细菌素，从而抑制肠道内有害菌的生长，调整胃肠环境，同时嗜酸乳杆菌还有防治结肠癌和降低体内胆固醇的作用。由于嗜酸乳杆菌优良的保健功能及耐酸和耐胆汁的特点，因而被称为第三代乳酸发酵剂，发展前景十分广阔，但嗜酸乳杆菌的生产特性差，凝乳时间长，风味口感不好，本研究利用球菌和杆菌之间相互促进的共生作用，将嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合培养，以求得最佳的生产效果，从实验结果可以看出：两种菌混合的产酸能力要高于

6、单独培养。影响凝乳时间各个因素的主次顺序为：其中接种量对对凝乳时间的影响要远远大于其它三个因素。影响产品感官评定指标各个因素的主次顺序为：其中加糖量对感官评定指标的影响最大，其次为接种量和培养温度，菌种配比的影响最小。综合考虑各因素对凝乳时间和感官评定的影响后得出和混合发酵生产酸奶的最佳工艺参数：接种量，加糖量，培养温度。1 材料和方法1.1材料培养基BCG牛乳培养基：A溶液脱脂乳粉100g，水500ml,加入溴甲酚绿（BCG）乙醇溶液1ml,80灭菌20min,B溶液酵母膏10g，水500ml,琼脂20g,PH6.8,121湿热灭菌20min,以无菌操作趁热将AB溶液混合后倒平板。细菌培养基

7、1.成分：牛肉膏0.5g,蛋白胨1.0g,NACL0.5g,蒸馏水100ml,PH7.27.5。2.制法：加热溶解，调PH值，分装于三角瓶中121,20min高压灭菌。脱脂乳试管直接选用脱脂乳液或脱脂乳粉与5%蔗糖水为1：10的比例配制，装量以试管的1|3为宜，115灭菌15min。原料，脱脂乳粉，全脂灭菌的纯牛奶1L，蔗糖。仪器及用具：恒温水浴锅，酸度计，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养箱，酸乳瓶（200300ml），灭菌的平板培养皿，300ml三角瓶，试管，移液管。1.2方法制备平板培养基配BCG溶液，0.8gBCG加入50ml 20%乙醇中，其中20%乙醇由25ml 95%的酒精+75m

8、l蒸馏水制成，然后配A溶液B溶液，分开灭菌，各500ml,在无菌操作台上趁热将A溶液B溶液混合均匀后，倒平板30个。制备稀释液（无菌操作）将混合菌种在无菌操作台上倒入1L的全脂灭菌的纯牛奶中，盖好盖子，在37恒温培养箱中培养68h,再取出，用手摇动，感觉是否变稠状。然后用灭菌的移液管取0.5ml放入4.5ml无菌水的试管中，依次稀释到10-5，取10-410-5两个稀释度的稀释液各0.10.2ml，分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上各5个平板，用无菌涂布器依次涂布;或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离，置40培养48h,将接种好的培养皿倒置，即平皿盖朝下放置。用于进一步纯化分离或直接转接斜面，

9、 平板划线分离微生物.1 倒平板 按无菌操作要求，在酒精灯火焰旁边操作，取融化并冷却至不烫手的培养基，倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固，备用。.2 划线分离 使用接种环，分别从10-410-5两个稀释度所倒的平板培养基中挑取不同的单菌落，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，依次编号为A1-A5，然后将接种好的培养基倒置，于40中恒温培养48h。1 微生物的复筛培养3天后再按照平板划线的方法从A1-A5培养基中挑取单菌落接种到相应的平板培养基，依次编号为B1-B5，然后将接种好的培养基倒置，于40中恒温培养48h。 微生物的镜检及鉴定.1 观察菌落的基本形态从各

10、培养基中选取不同的单菌落，观察其形状及颜色，并记录。.2 观察该菌株的活菌（常用压滴法）首先将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。将酒精灯放于自己的正前方，点燃。然后用无菌操作方法挑取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀,把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。接着用镊子取一洁净的载玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。如菌液过多，可用吸水纸吸去一部分。先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗些。21.2.4.3菌种的鉴定选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40培养824h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状（两种

11、形状的菌种均分别选入），革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代46次，最终选择出在36h能凝乳的牛乳管，作菌种待用。1.2.5 .乳酸菌的饮料的制作.1将脱脂乳和水以1：710（W/V）的比例，同时加入5%6%蔗糖，充分混合，于8085灭菌1015min，然后冷却至3540，作为制作饮料的培养基质。将纯种嗜热链球菌嗜酸乳杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂3，均以2%5%的接种量分别接入以上培养基基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装35瓶，随后将瓶盖拧紧密封。.2把接种后的酸乳瓶置于4042恒温培养箱中培养34h。培养时注

12、意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入45的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(PH4.04.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。.3以品尝为标准评定酸乳质量 采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株酸乳发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。比较项目见表2。1.2.6 微生物的生理生化性质的测定1.2.6.1 革兰氏染色首先制片、涂菌 ，用无菌操作方法分别从试管中沾取菌种一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀，直径约1cm的菌膜，涂菌后接种环火焰灭菌。干燥 于空气中自然干燥.亦可把玻片置于火

13、焰上部略加温加速干燥（温度不宜过高）。固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于颜料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰三次，以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形，此制片可用于染色。初染 于制片上滴加结晶紫染液染，1分钟后，用水洗去剩余染料。媒染 滴加卢戈氏碘液，1分钟后水洗。脱色 滴加95乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止（根据涂片之厚薄需时30秒至1分钟），水洗。复染 滴加石炭酸复红液复染1分钟，水洗。用滤纸吸干，油镜镜检。最后观察并记录结果发酵性能的测定4将分离得到的4株菌以5%的比例接种于无菌脱脂乳培养基中，37恒温培养箱中发酵8h，冷却并在冰箱中冷藏（4）10h后

14、定各指标。滴定酸度的测定：取待测酸乳样品，用浓度为10g|L的氢氧化钠溶液测定滴定酸度；PH值的测定：取待测酸乳样品，用ZD-2型自动电位测定仪测定PH值；黏度的测定：取酸乳样品中用NDJ-8S型数显黏度计测定黏度；保水率的测定：在离心管中各放入质量W为10g的酸乳，于3000r|min离心10min。 2.结果与分析2.1酸奶中微生物的的稀释分离恒温箱培养后1-5号培养基上面都有菌落长成，根据菌落形态初步判断有乳酸菌。2.2平板划线分离微生物划线分离后恒温培养结果：各培养基上均有单菌落生成。 2.3 微生物的复筛各培养基上长出的菌落形态颜色较为均一，可以作为下一步实验的对象，其他培养基上的菌

15、落差异较大。2.4 微生物的镜检及鉴定（1） 保加利亚杆菌细胞形态长杆状，两端钝圆。固体培养基生长的菌落呈棉花状。易于其他乳酸菌区别。能利用葡萄糖果糖乳糖进行同型乳酸发酵产生D型乳酸（又酸涩味，适口性差），不能利用蔗糖3。该菌是乳酸菌中产酸能力最强的菌种，其产酸能力与菌体形态有关，菌形越大，产酸越多，最高产酸量2%。如果菌形为颗粒状或细长链状，产酸较弱，最高产酸量1.3%2.0%。蛋白质分解能力较弱。发酵乳中可产生香味物质乙醛，最适生长温度3745，温度高于50或低于20不生长。常作为发酵酸奶的生产菌。（2） 嗜酸乳杆菌细胞形态比保加利亚杆菌小，呈细长杆状，能利用葡萄糖果糖乳糖和蔗糖进行同型乳

16、酸发酵产生D型乳酸，生长繁殖需要一定的维生素等生长因子，37培养生长缓慢，23d可使牛乳凝固。因而在发酵剂制造及嗜酸菌乳生产中，常在原料中加入5%的番茄汁或胡萝卜汁。蛋白质分解能力较弱。最适生长温度37，20以下不生长，耐热性差。最适生长PH5.56.0，耐酸性强，能在其他乳酸菌不能生长的酸性环境中生长繁殖。（3） 嗜热链球菌。细胞形态呈长链球状，无鞭毛，不产芽孢，单个或呈链状排列，在琼脂培养基上培养48h，菌落呈奶黄色，圆形，规则，较湿润，直径约0.61.0mm，表面光滑，质地均匀。某些菌落若不经过中间牛乳培养则在固体培养基上得不到菌落；能利用葡萄糖果糖乳糖和蔗糖进行同型乳酸发酵产生L型乳酸

17、。在石蕊牛乳中不还原石蕊，可使牛乳凝固。蛋白质分解能力较弱。在发酵乳中可产生香味物质双乙酰。该菌主要特征是能在高温条件下产酸。最适生长温度4045，温度低于20不产酸。耐热性强，能耐6568的高温8。常作为发酵酸乳瑞士干酪的生产菌。（4）双歧杆菌最适生长温度3741，最低生长温度2528，最高4345。初始最适PH 6.57.0,在PH4.55.0或8.08.5不生长。其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形纤细杆状具有尖细末端形球形长杆弯曲形分枝或分叉形棍棒形或匙形。单个或链状V形栅栏状排列，或聚集成星状。革兰氏染色阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。双歧杆菌的菌落光滑凸圆边缘完整乳脂至白色闪光并具

18、有柔软的质地。2.5 微生物的生理生化性质的测定 革兰氏染色 革兰氏染色反应的机理，主要由于这两类细菌细胞壁的机构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有的细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而被保留到细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层

19、较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。该菌株革兰氏染色呈蓝紫色，故其为革兰氏阳性菌。表1 感官评定评分 百分制口感（30分）具有酸奶特有的细腻润滑及稠厚感爽口2530；较细腻润滑稠厚感不强或稀薄1524；较为粗糙，有砂粒状或砂状口感，或如饮水状15;滋味和气味(40分)有发酵乳特有的滋气味酸甜适口风味协调3540；风味较淡酸甜可口，勉强接受2034；风味淡薄气味不协调，不能接受20组织状态（30分）凝乳均匀，无杂质，无或有少量乳清析出2530；凝乳较均匀，有乳清析出1524；凝乳不均匀

20、，乳清析出严重15；表二 乳酸菌单发酵及混合发酵的酸乳品评结果品评项目 乳酸菌类凝乳情况口感香味异味嗜酸乳杆菌 凝乳时间长凝乳不均匀，乳清析出严重较为粗糙，有砂粒状或砂状口感，或如饮水状。风味淡薄。气味不协调，不能接受。嗜热链球菌凝乳时间较短，凝乳较均匀，有乳清析出。较细腻润滑稠厚感不强或稀薄。风味较淡酸甜可口。勉强接受。球菌杆菌混合1：1凝乳时间也大为缩短，凝乳均匀，无杂质，无或有少量乳清析出。具有发酵乳特有的滋气味酸甜适口风味协调。酸甜适口。风味协调。结论：嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵的酸奶风味明显优于嗜酸乳杆菌单独发酵，凝乳时间也大为缩短。3.酸奶生产过程中常出现的问题及解决方法3.1

21、酸乳硬度不够，稀薄或黏糊状原料乳中蛋白质含量不足，发酵剂接种量过少，发酵时间偏低，原料乳的热处理和均质处理不够恰当，这些都会影响酸乳的质地和结构。应该调整原料乳配方，增加蛋白质含量，避免提前搅拌，适当增加稳定剂用量。3.2产酸缓慢原料乳中含有抗生素，原料乳干物质含量低，原料乳中杂菌数高，菌种基因发生负突变，对冻干菌种活化传代次数不够而尚未恢复活力，乳中含有其它抑菌物质，这些都会导致酸乳发酵剂产酸缓慢。应该在生产酸乳前对原料乳中的抑菌物质或抗生素进行严格检测，发酵剂要严格按要求进行无菌操作，并尽可能在标准条件下培养，制备好的发酵剂要进行菌种活力鉴定，根据其活力调整生产接种量，并适当控制培养温度。

22、3.3芳香味不够酸乳口味与菌种种类原料乳品质密切相关，同样型号的菌种采用不同的原料乳，可以生产出口味截然不同的酸奶，反之，同样的原料乳采用不同型号的菌种，也可以生产风味迥异的酸奶，这与不同的菌种构成有关。解决酸乳芳香味不够的措施是，在确保原料乳品质没有缺陷的前提下，采用适合当地消费者口味的菌种或调整球菌与杆菌比例，延长发酵时间，适当增加发酵温度，增加乳固形物含量，减少菌种产黏能力，确保发酵乳酸化到足够的酸度并进行发酵，使菌种的风味物质能充分产生。3.4乳清析出严重乳清析出是酸乳中最常见，也是最容易产生的现象。引起乳清析出的原因就是原料和发酵剂。对于因原料影响而产生的乳清析出，可以对原料进行标准

23、化处理，即加大原料中固形物含量，加入脱脂乳粉或对原料进行浓缩，要求原料乳的酸度在18.T以下，杂菌数不得高于50*104cfu/ml，均质处理可使原料充分混匀；对于因发酵剂的菌种老化活力弱，使得发酵时间延长，乳清析出严重的问题，可以使用直投式发酵剂加以解决。4.讨论与展望：嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵的酸奶风味明显优于嗜酸乳杆菌单独发酵，凝乳时间也大为缩短，虽然传统酸奶生产中保加利亚杆菌和嗜热球菌的比例 1：1 ，考虑到嗜酸乳杆菌产香，产酸能力较弱，所以杆菌和球菌的比例为 2：1 是适合的，接种量对酸奶生产及品质的影响非常明显，加大接种量可以缩短乳酸菌生长的延迟期，提高产酸速度，缩短凝乳时间

24、，但对于产品风味而言，接种量过大会产生不利影响。一般认为，接种量小有利于球菌生长，接种量大有利于杆菌生长。为了酸奶特殊风味的形成，球菌或杆菌的生长都不易过于旺盛，实验显示接种量小时产品风味最佳。生产酸奶时，加入适当的蔗糖可使产品具有良好风味，凝块细腻光滑。从实验结果可以看到，随着加糖量的提高凝乳时间随之延长，这说明蔗糖浓度过高抑制了嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的生长，但对于感官品质，加糖量越大，评分越高。为了增加嗜酸乳杆菌发酵乳的适口性，适当提高加糖量是应该的，培养温度对酸奶生产和品质的影响很大，嗜酸乳杆菌的最适生长温度为 37，和嗜热链球菌的最适生长温度为45 ，从数据分析中看到培养温度越高，凝乳

25、时间越短，产品风味越差，经过综合考虑，我们把最佳温度定在中间水平即40。参考文献：1沈萍，范秀容，李广斌微生物学实验(第三版)M北京：高等教育出版社， 1999214-2222李顺鹏微生物学实验指导M北京：中国农业出版社，2003：58-703 王淑军，韦友兵，潘元兵.酸乳制品种乳酸菌分离筛选方法研究J.淮海工学院学报（自然科学版）,1997,9(6)：32-34.4 凌代文.乳酸细菌分离鉴定及实验方法M.北京：中国轻工业出版社，1999.5 吕兵，张国农，肖光辉.新型酸奶发酵剂的研究J.中国乳品工业, 1999，27（5）：27-29.6 汪川，张朝武，余倩.酸奶中保加利亚乳杆菌分离条件的优化J.中国微生态学杂志, 2001， 4（13）：73-75.7 孟和毕力格，李少英，双杰. 酸奶制品中乳酸菌的分离鉴定与发酵性能的研究J. 中国乳业，2001（10）：15-18.8 周家春. 乳酸菌菌种的简便分离和培养.食品科学, 1998，19（1）：39-419 Altieri, C; Bevilacqua, A; DAmato, D; Nobile, MAD; Sinigaglia, M：Modelling t