一株沼泽红假单胞菌的分离鉴定及应用研究

1、一株沼泽红假单胞菌 VOTO1-G 的分离鉴定及应用研究摘要: 目的 分离、筛选去除富营养化水体营养盐的高效菌株。方法 采用富集、培养常规细菌分离方法，经过多次分离纯化，从河流沉积物中筛选出 1 株光合细菌菌株，命名为 VOTO1-G。在研究其生长规律的基础上，采用分子生物学方法对该菌株进行了鉴定。将分离纯化的光合细菌富集培养后进行除污试验，探讨其不同浓度的除污效果。结果 通过形态学、革兰染色、并结合 16S rDNA 序列同源性分析，其鉴定结果为沼泽红假单胞菌( Rhodopseudomonas palustris) 。通过对该菌株在培养过程中吸光度的测定，进一步研究了其生长规律: 在 5

2、10 天，活菌数迅速增加，处于对数生长期，在 10 14 天，处于稳定期。利用不同投加量的沼泽红假单胞菌对富营养化河流水体进行处理研究，筛选的菌株具有一定的脱氮除磷、去除有机物的能力。COD、TP、TN 的去除率分别为 12% 、25% 、13% 。结论 从河流沉积物中分离出的沼泽红假单胞菌具有一定的脱氮除磷、去除有机物的能力。关键词: 光合细菌 沼泽红假单胞菌 富营养化 河流沉积物 景观水体Photosynthetic bacteria of Rhodopseudomonas palustrisisolated from river sedimentAbstract: Objective O

3、ne strain of photosynthetic bacteria associated with highlyremoval capability of pollutant was isolated，and investigated about its growth MethodsBy using an enrichment culture and plate dilution method，one strain of bacteria，namedVOTO1-G，was isolated from river sediment mainly received domestic wast

4、ewater TheVOTO1-G bacteria was researched about its growth law， and identified by molecularbiology method，and further used to test its ability in the removing of nitrogen，phosphorusand organic compound from eutrophic water by 0. 05，0. 1 and 0. 2 Results Bychecking the individual morphology，colony cu

5、lture characteristics，DNA sequencing and16S rDNA gene bank， VOTO1-G was identified as Rhodopseudomonas palustris Theisolated bacteria strain had some nitrogen，phosphorus and organic compound removalability Conclusion One strain of photosynthetic bacteria was successfully isolated fromsewage sediment

6、s Its removal capacity of nitrogen，phosphorus and organic compoundfrom eutrophic water was good，which removed COD 12% ，TP 25% ，TN 13% Key words: photosynthetic bacteria，Rhodopseudomonas palustris，eutrophication，river sediment，eutrophic water第 6 期 王琳，等 . 一株沼泽红假单胞菌 VOTO1-G 的分离鉴定及应用研究 939近年来，国内外关于光合细菌去

7、除水体中营养物质的报道很多1-5，主要集中在发展生物脱氮除磷的新工艺和新概念6-7、菌株选育8-10等方面。在菌种的选育方面，虽然已经发现了多种不同类型的光合细菌，但是不同光合细菌的脱氮除磷能力不同。如何获得高效的降解菌株以及如何使其成为反应体系中的优势种群而发挥更好的脱氮除磷效果仍然是研究的热点。本试验从受纳生活污水的河流沉积物中分离、筛选光合细菌高效降解菌株，并采用形态学特征、分子生物学等多种方法进行鉴定，为研究其在富营养化水体中的脱氮除磷性能和相关污水的处理提供微生物基础。1 材料与方法1. 1 富集培养北京市清河主要是生活污水的受纳水体，氮、磷含量很高，其中总氮浓度( TN) 为 9.

8、 46mg/L( 以N 计) ，总磷浓度( TP) 为 0. 96mg / L( 以 P 计) 。取清河的底泥 100g 装入透明的玻璃圆桶标本缸内，与 1000ml 光合细菌液体富集培养基搅拌均匀，然后在标本缸上层加入液体石蜡以隔绝空气，在( 25 35) 下，以 4000 lx 光照强度培养 2 周。用无菌滴管从光合细菌生长良好的圆桶玻璃标本缸内壁处，吸取红色细菌和污水水样 5ml，移植到无菌试剂瓶中，加入灭菌后的富集培养液，加上橡皮塞，造成厌氧状态，继续光照，厌氧培养时保持( 25 35) ，试剂瓶中菌液的颜色逐渐变红。待生长良好后，再按上述同样步骤转接 3 次，至试剂瓶中菌液成棕红色，

9、红螺菌科细菌占优势。红螺菌科分离培养基: NH4Cl 0. 1g，MgCl20. 02g，酵母膏 0. 01g，K2HPO40. 05g，NaCl 0. 2g，琼脂 2g，蒸馏水 90ml，0. 1MPa 灭菌 20min。灭菌后，无菌操作加入经过滤除菌的 0. 5g/5ml NaHCO3; 再无菌加入过滤除菌的 0. 1g Na2S · 9H2O; 最后再加 5ml经过除菌的 4% 丙氨酸。用过滤灭菌的 0. 1mol/LH3PO4调 pH 至 7. 0。红螺菌科富集培养基: NH4Cl 0. 1g，NaHCO3( 5% NaHCO3水溶液，过滤除菌取 2ml 加入无菌培 养 基

10、中 ) 0. 1g，K2HPO40. 02g，CH3COONa0. 1g，MgSO4·7H2O 0. 02g，NaCl 0. 05g，生长因子( 维生素 B10. 001mg、尼克丁酸 0. 1mg、对氨基苯甲酸 0. 1mg、生物素 0. 001mg，以上药品溶于蒸馏水中，定容至 10ml，然后过滤除菌) 1ml，蒸馏水97ml，微量元素溶液 ( FeCl3·6H2O 5mg、CuSO4·5H2O 0. 05mg、H3BO41mg、MnCl2·4H2O 0. 05mg、ZnSO4·7H2O 1mg、Co ( NO3)2·6H2O 0

11、. 5mg，以上药品分别溶于蒸馏水中，并定容至 1000ml) 1ml，pH 7. 011。除 NaHCO3、生长因子和微量元素溶液外，各成分溶解后 0. 1MPa 灭菌 20min，然后再分别加入 NaHCO3、生长因子和微量元素溶液。1. 2 分离纯化分离用固体培养基: 在液体培养基中加入2% 的琼脂，其他成分不变。将已融化并冷却至( 45 50) 红螺菌分离培养基倾倒平板; 再用已经过过滤除菌的 0. 05%抗坏血酸溶液对富集培养的红螺菌科细菌菌悬液适当稀释; 以涂布分离法将稀释的红螺菌科细菌菌悬液在平板上，然后再倒入( 45 50) 红螺菌分离培养基，造成厌氧环境，( 25 35) ，

12、4000 lx光照下培养。待棕红色菌落出现后，挑单菌落在2ml 液体富集培养基中进行扩增培养。重复上述操作，反复进行涂平板挑单菌落，直至获得纯菌种。同时保存纯菌种: ( 1) 液态保存: 将液体培养基灭菌后接入菌种，经光照培养后，置于 4 冰箱中，以后每隔 30 天转接一次; ( 2) 固态保存: 制备固体培养基，挑取较大的菌落穿刺接种，经光照培养后用液体石蜡封口，用黑布包裹后，置于 70下，每隔一年转接一次12。1. 3 菌种的生长规律试验在菌种筛选试验的基础上，对获得的菌种进行细胞生长测定及其生长规律的试验研究。在光合细菌的富集培养基中按 20% 的接种量接种，在30 光照培养箱中培养，每

13、天同一时间取 3 个重复于波长 600nm 处，测其吸光度( A 值) ，以便将菌体培养到对数生长期的初期或在对数生长期到稳定期之间。1. 4 菌种的鉴定对所筛选到的菌株进行鉴定，通过观察菌落形态、显 微 镜 下 菌 体 形 态 观 察、革 兰 染 色、16SrDNA 扩增以及 DGGE 等分子生物学手段相结合的方法进行了菌株的鉴定等，依照微生物学细菌分类鉴定实验方法，对获得的菌株进行初步鉴定。1. 5 DNA 提取及 PCR-DGGE 技术1. 5. 1 样品准备和细菌 DNA 提取 取分离纯菌株的液体培养液于 8ml 离心管中，8000 r/min，4 ，离心 20min，弃上清液，取沉淀

14、，加入 0. 5mlDNA 提取缓冲液 ( 1mol / L Tris-HCl，pH 8. 0 ) 备用。单 菌 株 DNA 的 提 取 采 用 Benzyl Chloride方法13。1. 5. 2 PCR 扩 增 PCR 扩 增 采 用 AmpliTaqGoldTM反应系统 ( Perkin Elmer，Applied Biosyst-ems，NJ，USA) 。 引物为 357F 和 517R，它们的序940 卫 生 研 究 第 41 卷列 分 别 为 5 -CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ，5 -ATTACCGCGGCTGCTGG-3。PCR 的反应程序: 95 10min; 下

15、面的程序进行 25 个循环，93 1min，50 1min，72 1min30s; 之后，93 1min，50 1min，72 5min。 反应体系( 50l) : 1l dNTP( 10mmol/L) 、5l 10 ×PCR Gold Buffer、4l MgCl2( 25mmol/L) 、0. 5l357F( 45pmol / l) 、0. 5l 517R ( 45pmol / l) 、1l模板 DNA( 10ng/l) 和 0. 5l Taq 酶( 2U/ml) ，其余体积用无菌水补充。PCR 产物以 2% 琼脂糖凝胶电泳检测，经纯化后送测序公司测序，所获得的DNA 序列与 B

16、LAST 程序的数据库序列比较，确定菌株的分类地位。1. 5. 3 DGGE 电泳及 分析 采用 DCode 系 统( Bio-Rad，Laboratories，Hercules，Calif) 对 PCR 扩增产物用双变性法进行 DGGE 分析14。聚丙烯酰胺凝胶浓度为 6% 12% ，尿 素变性梯度为20% 55% ( 尿素为 7mol / L，甲酰胺为 40% 时的变性浓度为 100% ) ，在 61 恒温下，电压为 200V时 电 泳 5h，采 用 SYBRGREEN ( MolecularProbes，Eugene，Ore) 染色 30min，紫外凝胶成像系统分析结果15。1. 6 水

17、质净化试验设计试验水体取自北京动物园内有代表性的水域污染 比 较 严 重 的 水 禽 湖，水 体 COD 为87. 6mg / L，TN 为 1. 55mg / L，TP 为 0. 15mg / L，pH为 7. 3。将取回的水样分装在 3L 的锥形瓶中，每个瓶中装 1L 水，菌液的添加量为处理水体积的0. 05、0. 1 和 0. 2。 分别用灭菌后的 100ml离心管在无菌条件下取富集好光合细菌培养物，用无菌生理盐水离心洗涤 2 3 次( 4000r/min，每次 10min) ，再用无菌生理盐水稀释至相同体积，振荡混合均匀，制成菌体悬液于 4 冰箱中保存备用。投加微生物后以及微生物处理

18、5 天后，分别取样，测定水体中的 COD、TP、TN。研究所筛光合细菌是否具有脱氮除磷、去除有机物能力。1. 7 化学指标测定方法16总氮( TN) 为紫外分光光度法，总磷( TP) 为钼锑抗分光光度法，化学需氧量( COD) 为重铬酸钾氧化法，pH 采用 pH 计进行测定。2 结果2. 1 光合细菌的富集培养将采集的沉积物接种到紫色非硫细菌液体富集培养基中，经过 7 天左右，培养液开始出现浅红色，经 4 5 次转接培养后，颜色逐渐加深，呈紫红色，此时主要是紫色非硫细菌科的混合菌。2. 2 细胞形态特征和菌落特征采用平板分离的方法得到纯菌株，命名为VOTO1-G，该菌株在光照厌氧和黑暗好氧条件

19、下均能生长，属于兼性厌氧菌。VOTO1-G 菌株革兰染色为阴性，单个细胞为卵形或短杆状( 图 1) ，菌体大小为( 0. 6 0. 9) × ( 1. 2 2. 0) m。单菌落在分离固体培养基上呈棕红色( 图 2) ，直径 1 2mm，表面光滑湿润，中央突起，边缘整齐。图 1 菌株 VOTO1-G 的显微照片Figure 1 Light micrograph of strainVOTO1-G showing cell shape图 2 VOTO1-G 菌株的菌落Figure 2 Colony of strain VOTO1-G2. 3 VOTO1-G 菌株的生长曲线在 0 5 天，

20、这一时期为光合细菌的延滞期( 见图 3) ，在 5 10 天，活菌数迅速增加，处于对数生长期，在此阶段，VOTO1-G 菌株生长活跃，大量繁殖; 在 10 14 天，处于稳定期。在应用中常选择既保持旺盛增殖能力，又达到较高的浓度以缩短发酵周期17。因此，选取培养至 9 天的菌体进行水质净化试验。2. 4 DGGE 分析将光合细菌液体培养液收集后用氯苯法提取DNA，将提取的 DNA 进行 2% 琼脂糖电泳，然后进行 16S rDNA V3 区序列 PCR 扩增，将 PCR 扩增产物进行 DGGE 电泳，电泳图谱如图 4，从 DGGE图中可以检测到只有一条带。2. 5 菌种鉴定经过平板分离纯化和

21、DGGE 筛选，确定获得的菌株 VOTO1-G 是纯菌种。通过 16S rDNA 基因测序并与 NCBI 基因数据库中已有菌种的 16S第 6 期 王琳，等 . 一株沼泽红假单胞菌 VOTO1-G 的分离鉴定及应用研究 941图 3 VOTO1-G 菌株的生长曲线Figure 3 Growth curve of strain VOTO1-Gwhen it was culturedM: Maker; G: VOTO1-G图 4 VOTO1-G DGGE 图谱Figure 4 DGGE profile of V3 regionof 16S rDNA from VOTO1-GrDNA 序列进行同源性

22、分析和相似性分析，在分子水平对 VOTO1-G 进行系统发育、种属鉴定。在显微镜下观察菌体细胞主要为卵形或短杆状( 见图 1) ，平板上培养的菌落为深红色( 见图2) ，通过 16S rDNA 基因序列并与数据库近缘种Rhodopseudomonas palustris ( AB275664 ) 进行比较分析，相似率为 93. 2% ，根据同源性检索和相似性分析 鉴 定 菌 株 VOTO1-G 为 沼 泽 红 假 单 胞 菌( Rhodopseudomonas palustris) ，登录号为 FJ6955-08。目前，沼 泽 红 假 单 胞 菌 ( Rhodopseudomonaspalus

23、tris) 是研究和应用较广泛的一种光合细菌。( 1) 在废水处理研究上。KIM 等18从水产养殖水体的光合污泥中筛选到一株其强烈脱氮作用的沼泽红假单胞菌，能够把水体中硝酸盐转化为氮气去除，而在转化过程中，只积累了少量的亚硝酸盐。SAWAYAMA 等10从厌氧污泥反应器中分离到一株沼泽红假单胞菌用于污水中有机物的去除。HONDA 等19在实验室条件下，在反应器中接种沼泽红假单胞菌去除水体中可溶性有机碳。( 2) 产类胡萝卜素和辅酶 Q10的研究。类胡萝卜素不仅具有增色功效，而且还具有营养功能。同时用经发酵法生产类胡萝卜素工艺又具有较高的安全性、低成本及强着色力等优点，一直受到格外青睐。方立超等

24、8从水塘污泥中分离到一株产辅酶 Q10的菌株，进 16S rDNA 序列分析表明是沼泽红假单胞菌。( 3) 在水产养殖业中的应用。在水质净化方面，邱宏端等9选育出的沼泽红假单胞菌在 0. 1% 0. 4% 的盐度下均具有较高的去除 NH+4、NO-2的能力。( 4) 降解有机污染物。KAMAL 和 WYNDHAM4、KROONEMAN 等5研究表明沼泽红假单胞菌能够降解 3-氯苯甲酸，能够对染料进行脱色和降解20。( 5) 其它领域的研究。MARIA 等21和 YOU 等22从能源的角度对沼泽红假单胞菌产氢进行了研究。2. 6 水质净化生物降解过程中存在一个微生物浓度和水体中污染物相对应的关系

25、，也就是在一定的投菌浓度下，污染物存在一个能够被有效降解的适宜浓度。本试验以小水体( 1L) 探讨沼泽红假单胞菌净化富营养化水体的初步效果以及适宜的投菌浓度。经过 5 天的处理，各处理的 COD、TP、TN 的去除率如表 1 所示。沼泽红假单胞菌对富营养化水体中的 COD、TP、TN 均有一定的去除效果。该研究中，沼泽红假单胞菌在投菌浓度为 0. 1时处理效果较好。表 1 沼泽红假单胞菌处理富营养化水体5 天后的 COD、TP、TN 去除率Table 1 After 5 days treatment the removal ratesof COD、TP、TN处理投菌浓度( )COD( % )T

26、P( % )TN( % )空白 0 5. 20 ± 2. 0 14. 9 ± 0. 3 6. 4 ± 0. 5光合细菌 0. 05 12. 1 ± 0. 2 23. 2 ± 1. 0 12. 2 ± 1. 00. 1 12. 7 ± 0. 3 25. 5 ± 1. 0 13. 9 ± 0. 20. 2 12. 0 ± 0. 2 23. 6 ± 1. 1 12. 2 ± 0. 43 结论( 1) 采用常规细菌分离方法，成功地从受纳生活污水的河流沉积物中分离出了 1 株光合细菌，

27、命名为 VOTO1-G，并探索出了其分离、纯化方法。通过对 VOTO1-G 菌株进行形态学、革兰染色、16S rDNA 序列同源性分析，鉴定为沼泽红假942 卫 生 研 究 第 41 卷单胞菌 ( Rhodopseudomonas palustris) 。进一步研究其生长规律，发现光合细菌 VOTO1-G 在 5 10d，活菌数迅速提高，处于对数生长期，为水质净化提供依据。( 2) 采用沼泽红假单胞菌 VOTO1-G 对北京市动物园内的富营养化的景观水体进行预处理研究，经过 5 天的处理，不同的投加浓度对富营养化水体中的 COD、TP、TN 均有一定的去除效果。其中投加 量 为 0. 1 时，

28、去 除 效 果 较 好。这 表 明VOTO1-G 具有一定的脱氮除磷、去除有机物的能力，这对于城市污水脱氮除磷、去除有机物工艺的发展具有重要意义。( 3) 该试验只是初步探讨所筛选菌株对富营养化水体具有一定的净化效果，应进一步分析其投加该菌株后水质的变化特点，以及对不同富营养化程度的水体进一步研究，探索出富营养化程度和投菌浓度的线性关系，以便达到经济、有效。参考文献1 李景生，黄韵珠 . 应用 PSB 处理乳产品厂废水的试验研究J. 环境科学学报，1997，10( 3) : 17-202 樊凌雯，张肇铭，张德咏，等 . 利用光合细菌法处理糖蜜酒精发酵废液中试研究J. 中国环境科学，1998，1

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