第22章免疫学检测技术的基本原理学习教案

1、会计学1第第22章章 免疫学检测免疫学检测(jin c)技术的基本原理技术的基本原理第一页，共45页。本章本章(bn zhn)内容内容第1页/共44页第二页，共45页。第一节第一节 基于抗原基于抗原(kngyun)-(kngyun)-抗体反应的检测方法抗体反应的检测方法一、抗原抗体反应概念一、抗原抗体反应概念抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）

2、。由于实验所用所用(su yn)抗体存在于血清中，故又称血清学反应。抗体存在于血清中，故又称血清学反应。第2页/共44页第三页，共45页。二、抗原二、抗原(kngyun)抗体反应的特点抗体反应的特点高度特异性高度特异性 可精确区分物质间极微细的差异。可精确区分物质间极微细的差异。表示为表示为亲和力：一个抗原亲和力：一个抗原(kngyun)表位与相表位与相应抗体单一抗原应抗体单一抗原(kngyun)结合位点间结合位点间的结合能力。的结合能力。亲合力：指一个抗体分子与整个抗原亲合力：指一个抗体分子与整个抗原(kngyun)大分子间的结合强度，与抗大分子间的结合强度，与抗原原(kngyun)表位数目

3、有关。表位数目有关。第3页/共44页第四页，共45页。2.抗原抗体抗原抗体(kngt)结合的带现象与可见性结合的带现象与可见性 抗原抗体抗原抗体(kngt)结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体(kngt)浓度和比例（等带）决定抗原抗体浓度和比例（等带）决定抗原抗体(kngt)结合后能否出现肉眼可见的反应；结合后能否出现肉眼可见的反应；第4页/共44页第五页，共45页。3. 表面化学基团之间的可逆结合表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键(qn jin)、范、

4、范德华力和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的德华力和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可借助亲和层析影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。法纯化抗原或抗体。抗原抗体反应的抗原抗体反应的2个阶段个阶段第第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；第第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。，所需时间从数分钟至数日不等。第5页/共44页

5、第六页，共45页。三、抗原抗体反应的影响因素三、抗原抗体反应的影响因素电解质电解质 抗原抗体等电点分别为抗原抗体等电点分别为pH3-5和和pH5-6，在，在中性中性(zhngxng)或弱碱性条件下表面带有较多负电或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷荷，适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而相互结合；而相互结合；温度温度 通常为通常为37，适当提高反应温度可增加抗原，适当提高反应温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，但与抗体分子的碰撞机会，但56以上可使抗原或抗以上可使抗原或抗体变性失活；体变性失活；酸碱度酸碱度 抗原抗体反应的最适抗原抗体反应的最适pH值

6、在值在6-8之间，之间，pH值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当当pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。第6页/共44页第七页，共45页。四、抗原抗体反应检测四、抗原抗体反应检测(jin c)技术的应用技术的应用抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可

7、呈现某种反应现象（如凝集、沉淀抗体特异性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在于血清中，故又称血清学）。由于实验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。反应。第7页/共44页第八页，共45页。五、抗原五、抗原-抗体反应的基本检测抗体反应的基本检测(jin c)方法方法第8页/共44页第九页，共45页。AbAg高亲和力AbAg低亲和力特异性特异性结合力的表示结合力的表示(biosh)方方法法亲和力和亲合力亲和力和亲合力低亲合力高亲合力Ag-Ab反应反应(fnyng)的原理的原理第9页/共44页第十页，共45页。Ab 过剩Ag 过剩比例适当，交联成网络Ag-Ab反应反应(fn

8、yng)的可见性的可见性第10页/共44页第十一页，共45页。1.凝集反应凝集反应直接(zhji)凝集反应 1:2稀释(xsh)待测血清 1:4 1:8 1:16 细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况(qngkung)下直接反应，二者比例合适时，出现肉眼可见的凝集团现象。玻片法试管法常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定选择最佳稀释浓度，常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。第11页/共44页第十二页，共45页。间接间接(jin ji)(jin ji)凝集反应凝集反应将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载

9、体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测(jin c)。凝集反应常用于溶血性疾病的诊断：+病人病人(bngrn)的的RBC体内体内anti-Rh由于抗体多属于由于抗体多属于IgG，分子量较小，分子量较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现凝集间的排斥力，不出现凝集+体外加入抗体外加入抗人人IgG出现凝集现象，出现凝集现象，叫叫直接库姆试验直接库姆试验正常人正常人O型血的型血的Rh+的的RBC+患者血清内的游离患者

10、血清内的游离anti-Rh+体外加入体外加入抗人抗人IgG出现凝集现象，叫出现凝集现象，叫间接库姆试验间接库姆试验第12页/共44页第十三页，共45页。2.沉淀沉淀(chndin)反应反应AgAgAgAgAb in gel单向单向(dn xin)免疫扩散免疫扩散Ag1AbAg2Ag3Ag4双向免疫扩散双向免疫扩散免疫免疫(miny)比浊比浊过量Ab Ab Ab Ab毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。鉴定多种抗原是完全相同鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同、部分相同或完全不同用

11、于确定用于确定抗原浓度抗原浓度第13页/共44页第十四页，共45页。沉淀沉淀(chndin)反应反应免疫电泳免疫电泳存在于不同存在于不同(b tn)区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。第14页/共44页第十五页，共45页。3.免疫免疫(miny)标记技术标记技术免疫免疫(miny)酶测定法酶测定法免疫免疫(miny)荧光技术荧光技术放射免疫放射免疫(miny)测定测定法法免疫免疫(miny)胶体金技术胶体金技

12、术第15页/共44页第十六页，共45页。免疫免疫(miny)酶测定法酶测定法夹心法夹心法ELISA间接间接ELISABASELISA 利用生物利用生物素和抗生物素蛋白为桥素和抗生物素蛋白为桥梁梁微粒捕获酶免疫分析技微粒捕获酶免疫分析技术术 将已知特异性抗体致将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素敏的免疫微粒与生物素、亲和素、酶相结合，、亲和素、酶相结合，最后酶作用于荧光底物最后酶作用于荧光底物发光，通过检测荧光强发光，通过检测荧光强度判断未知抗原度判断未知抗原(kngyun)的含量。的含量。a）b）第16页/共44页第十七页，共45页。免疫组化技术免疫组化技术(jsh)定位、定性(dng xn

13、g)、定量检测第17页/共44页第十八页，共45页。免疫荧光技术免疫荧光技术(jsh)(jsh)第18页/共44页第十九页，共45页。放射免疫测定放射免疫测定(cdng)(cdng)用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素(j s)、药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。化学发光免疫化学发光免疫(miny)(miny)技术技术将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。灵敏度高、简便、可实现自动化分析。第19页/共44页第二十页，共45页。免疫免疫

14、(miny)(miny)胶体金技术胶体金技术用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。氯金酸在还原剂作用(zuyng)下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用(zuyng)而呈稳定的胶体状态。该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。第20页/共44页第二十一页，共45页。免疫免疫(miny)(miny)印迹法印迹法-Western blotting-Western blotting第21页/共44页第二十二页，共45页。4.4.蛋白质芯片蛋白质芯片(xn pin)(xn pin)技术技术又称为蛋白质微列阵，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成

15、(guchng)的微列阵。根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。第22页/共44页第二十三页，共45页。第二节第二节 免疫免疫(miny)(miny)细胞检测细胞检测淋巴细胞及其亚群淋巴细胞及其亚群的分离的分离(fnl)免疫细胞免疫细胞功能功能(gngnng)测定测定磁珠分离磁珠分离法法免疫吸附分免疫吸附分离法离法流式细胞术流式细胞术肽肽MHC四四聚体技术聚体技术T细胞功细胞功能测定能测定B细胞功细胞功能测定能测定细胞因子细胞因子检测检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒试验细胞毒试验吞噬功能测吞噬功能测定定51Cr释放

16、法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法第23页/共44页第二十四页，共45页。一、免疫一、免疫(miny)细胞及其亚类计数细胞及其亚类计数稀释血液淋巴细胞分离液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078) 离心单 个核细胞(PBMC，包括淋巴细胞、DC和NK)红细胞和粒细胞血浆外周血单个核细胞外周血单个核细胞(xbo)的分离的分离第24页/共44页第二十五页，共45页。外周血单个核细胞外周血单个核细胞(xbo)的分离的分离稀释血液淋巴细胞分离液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078) 离心单 个核细胞(PBMC，包括淋巴细胞、DC和NK)红细胞和粒细胞血浆第25页

17、/共44页第二十六页，共45页。磁珠分离法磁珠分离法免疫吸附分离法免疫吸附分离法流式细胞术流式细胞术肽肽MHC四聚体技术四聚体技术(jsh)淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离(fnl)第26页/共44页第二十七页，共45页。免疫吸附分离法免疫吸附分离法加入淋巴细胞悬液anti-CD4anti-CD4anti-CD4弃上清第27页/共44页第二十八页，共45页。磁珠分离法磁珠分离法第28页/共44页第二十九页，共45页。流式细胞术流式细胞术荧光抗体(kngt)标记混合细胞喷嘴(pnzu)单细胞悬液5000-10000个/秒细胞(xbo)分选器荧光检测器第29页/共44页第三十页，共45

18、页。抗原抗原(kngyun)肽肽-MHC四聚体分离技术四聚体分离技术亲和素亲和素抗原抗原(kngyun)肽肽MHC I生物素生物素anti-CD8肽-四聚体肽特异性CD8TCD4T及B非肽特异性CD8T荧光荧光(ynggung)素素第30页/共44页第三十一页，共45页。二、免疫细胞二、免疫细胞(xbo)(xbo)功能的测定功能的测定T细胞细胞(xbo)功能功能测定测定B细胞细胞(xbo)功功能测定能测定细胞因细胞因子检测子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒细胞毒试验试验吞噬功吞噬功能测定能测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检

19、测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法第31页/共44页第三十二页，共45页。T细胞细胞(xbo)功能功能测定测定T细胞增殖(zngzh)试验迟发型(f xn)超敏反应的检测T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测：形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁；3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。1.MTT (四甲基偶氮唑盐)比色法：外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T

20、细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染。第32页/共44页第三十三页，共45页。B细胞功细胞功能能(gngnng)测定测定抗体含量(hnling)测定溶血(rn xu)空斑试验可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。绵羊红细胞(SRB C)免疫动物4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀在抗体形成

21、细胞周围出现溶解的透明区，即溶血空斑。1个空斑区代表1个浆细胞通过记录溶血空斑的数目可知抗原特异性B细胞的数目加入新鲜补体，倒入平皿中培养第33页/共44页第三十四页，共45页。细胞毒细胞毒试验试验(shyn)51Cr释放(shfng)法乳酸(r sun)脱氢酶释放法细胞染色法靶细胞被杀伤后，向体系中加入台盼兰，可进入膜破损的细胞内，将细胞染成蓝色。活细胞拒染而不着色。第34页/共44页第三十五页，共45页。凋亡(dio wn)细胞检测法琼脂糖电泳(din yn)法正常细胞基因组DNA凋亡(dio wn)细胞TUNEL法在细胞中加入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和生物素标记的核苷酸TdT能在游离的DNA3端缺口连接标记的核苷酸加入亲和素-酶复合物，在DNA断裂处显色流式细胞术Annexin VPI凋亡早期凋亡晚期坏死期第35页/共44页第三十六页，共45页。巨噬细胞吞噬(tnsh)试验吞噬功能吞噬功能(gngnng)测定测定硝基(xio j)蓝四氮唑(NBT)试验NBT在杀菌过程中产生反应性氧中间物，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中。光镜下计数NBT阳性细胞可反映PMN的杀伤功能。将待测mf与鸡红细胞混合温育后