健康测定教学

1、第十七章第十七章转基因种子特定特性测定转基因种子特定特性测定 随着生物技术产品随着生物技术产品( (转基因品种转基因品种) )的问世，植的问世，植物转基因品种鉴定问题日益突出。物转基因品种鉴定问题日益突出。植物转基因品植物转基因品种的不断育成和商业化应用，在种子质量检测中种的不断育成和商业化应用，在种子质量检测中出现了新的挑战。这就是植物转基因品种种子的出现了新的挑战。这就是植物转基因品种种子的鉴定问题。鉴定问题。一、植物转基因品种鉴定的重要性一、植物转基因品种鉴定的重要性二、转基因种子特定特性测定的目的二、转基因种子特定特性测定的目的一是检测一是检测（DetectionDetection），

2、确定种子批中是否含），确定种子批中是否含有有GMOs GMOs ；二是鉴定二是鉴定（IdentificationIdentification），如果检测的结果是），如果检测的结果是阳性的，需要通过鉴定知道阳性的，需要通过鉴定知道GMOsGMOs是否是经授是否是经授权的，如果未经授权，种子批将被拒绝。如果权的，如果未经授权，种子批将被拒绝。如果是经授权，则进一步定量分析；是经授权，则进一步定量分析；三是定量三是定量（QuantificationQuantification），即通过定量分析，），即通过定量分析，确定种子批中的确定种子批中的GMOGMO是否超过是否超过极限值极限值。二、转基因种子特

3、定特性测定的目的二、转基因种子特定特性测定的目的 关于关于极限值极限值，欧盟，欧盟20032003年规定常规种子年规定常规种子批中含有外来批中含有外来GMOGMO的最大界限值的最大界限值是：甜油菜是：甜油菜（sweet rapesweet rape）0.3%0.3%，番茄、甜菜、棉花、菊，番茄、甜菜、棉花、菊苣、玉米和马铃薯苣、玉米和马铃薯0.5%0.5%，大豆，大豆0.7%0.7%，其它未，其它未经权威机构批准的基因为经权威机构批准的基因为0.0%0.0%。当超过极限当超过极限值时，种子批应标注出含有值时，种子批应标注出含有“ “ %GMO”%GMO”。二、转基因种子特定特性测定的目的二、转

4、基因种子特定特性测定的目的什么是什么是GMOsGMOs 是指是指凭借现代生物技术获得的遗传材料凭借现代生物技术获得的遗传材料新异组成的活生物体新异组成的活生物体。实际上就是将外源。实际上就是将外源DNADNA导入生物体基因组，引起了遗传改变，导入生物体基因组，引起了遗传改变，改变了遗传组成的生物，就是转基因生物。改变了遗传组成的生物，就是转基因生物。三、检测方法三、检测方法（一）国际规程对转基因种子检验方法采用一一）国际规程对转基因种子检验方法采用一种全新的规定种全新的规定 国际种子检验协会（国际种子检验协会（ISTAISTA）对于转基因检）对于转基因检测方法的规定采用了一种全新的方法，这种方

5、测方法的规定采用了一种全新的方法，这种方法称为法称为“以性能为基础检测方法以性能为基础检测方法”。以性能为以性能为基础的检测方法意味着检验室可以研发和（或）基础的检测方法意味着检验室可以研发和（或）使用一种在国际种子检验规程中还未公布的方使用一种在国际种子检验规程中还未公布的方法。法。 并且一旦当检验室通过性能数据正式认可并且一旦当检验室通过性能数据正式认可该方法后，就可以申请国际种子检验协会授权该方法后，就可以申请国际种子检验协会授权使用该检测方法。使用该检测方法。三、检测方法三、检测方法（二）主要检测方法（二）主要检测方法生物表现型检测方法生物表现型检测方法 特异蛋白质检测方法：特异蛋白质

6、检测方法：包括酶联免疫检测包括酶联免疫检测和横向侧流条测定；和横向侧流条测定； DNADNA检测方法：检测方法：包括包括PCRPCR定性和定量分定性和定量分析析第十八章第十八章种子健康测定种子健康测定第十八章第十八章 种子健康测定种子健康测定第一节第一节 概述概述一、种子健康测定的目的一、种子健康测定的目的1 1、有关定义、有关定义种子健康测定种子健康测定：测定种子是否携带有病原菌：测定种子是否携带有病原菌( (如真菌、如真菌、细菌及病毒细菌及病毒) )、有害的动物、有害的动物( (如线虫及害虫如线虫及害虫) )等健康状等健康状况。即对种子况。即对种子所携带病虫害种类所携带病虫害种类及及数量数

7、量进行检测进行检测。种传病害种传病害：在病毒侵染循环中的某一阶段和种子联：在病毒侵染循环中的某一阶段和种子联系在一起，其病原物附着、寄生或存在于种子表面系在一起，其病原物附着、寄生或存在于种子表面和内部，或混杂于种子中间，和内部，或混杂于种子中间，主要通过种子携带而主要通过种子携带而传播的传播的一类植物病害。一类植物病害。种子害虫种子害虫：在种子田间生长和贮藏期间，感染和危：在种子田间生长和贮藏期间，感染和危害种子的害虫。害种子的害虫。一、种子健康测定的目的一、种子健康测定的目的2 2、种子健康测定的目的、种子健康测定的目的 检测检疫性传染病害。检测检疫性传染病害。 确定种子批的使用价值。确定

8、种子批的使用价值。 评定种子批是否需要经过种子处理，以评定种子批是否需要经过种子处理，以及处理后的效果。及处理后的效果。 为调查或研究目的而评估某种传染病的为调查或研究目的而评估某种传染病的流行情况。流行情况。 探明发芽率低的原因，弥补发芽试验的探明发芽率低的原因，弥补发芽试验的不足。不足。二、种子健康检验的内容二、种子健康检验的内容 种子健康检验包括种子健康检验包括田间检验田间检验和和室内检验室内检验两两部分。部分。 田间检验田间检验是是根据病虫害的发生规率根据病虫害的发生规率，在一，在一定生长时期进行检验。作物在田间生长时期，定生长时期进行检验。作物在田间生长时期，病虫害表现明显，容易进行

9、检查，检查主要依病虫害表现明显，容易进行检查，检查主要依靠肉眼检验。尽管比较粗放，但非常重要，因靠肉眼检验。尽管比较粗放，但非常重要，因为有些带病种子在室内很难加以鉴定。为有些带病种子在室内很难加以鉴定。 室内检验室内检验是是贮藏、调种和引种贮藏、调种和引种过程中进行过程中进行病虫害检验的主要手段。病虫害检验的主要手段。三、种子健康测定方法的特点三、种子健康测定方法的特点1 1、种子健康测定方法主要有：、种子健康测定方法主要有：未经培养检查未经培养检查包括：直接检查、吸胀种子检直接检查、吸胀种子检查、洗涤检查、剖粒检查、染色检查、比查、洗涤检查、剖粒检查、染色检查、比重检查和重检查和X-X-射

10、线检查等。射线检查等。培养后检查培养后检查包括：吸水纸法、砂床法、琼脂吸水纸法、砂床法、琼脂皿法，以及噬菌体法和血清学酶联免疫吸附皿法，以及噬菌体法和血清学酶联免疫吸附试验法等。试验法等。2 2、种子健康检测方法应达到的要求、种子健康检测方法应达到的要求 使病原体容易识别；使病原体容易识别； 结果有重演性；结果有重演性； 样品间结果有可比性；样品间结果有可比性； 方法简单快捷且费用低；方法简单快捷且费用低； 能适合于国际贸易检测的要求。能适合于国际贸易检测的要求。三、种子健康测定方法的特点三、种子健康测定方法的特点三、种子健康测定方法的特点三、种子健康测定方法的特点3 3、检测结果的影响因素、

11、检测结果的影响因素 其他病原菌存在可能与被检测病原菌产其他病原菌存在可能与被检测病原菌产生干扰；生干扰； 检验室检测结果通常高于田间或温室的检验室检测结果通常高于田间或温室的检测结果；检测结果； 有些病原菌对培养条件敏感；有些病原菌对培养条件敏感； 种子已经处理；种子已经处理； 种传病菌生活力随着长时间贮藏而衰退种传病菌生活力随着长时间贮藏而衰退。四、种传病害的控制方法四、种传病害的控制方法1 1、确定检疫种类和划定检疫区域、确定检疫种类和划定检疫区域 通过法规，颁布检疫的种类，明确划定检疫区域和保护区域，通过法规，颁布检疫的种类，明确划定检疫区域和保护区域，是防止检疫对象扩展蔓延、保护农业生

12、产安全的重要措施。是防止检疫对象扩展蔓延、保护农业生产安全的重要措施。2 2、制定种子健康标准、制定种子健康标准 制定种传病害健康标准，是控制病害发生的一项重要措施。制定种传病害健康标准，是控制病害发生的一项重要措施。各国根据各自的国情，在种子认证中制定了种子健康的田间标准各国根据各自的国情，在种子认证中制定了种子健康的田间标准和室内标准。种子健康测定中，有些病害在田间观察很清楚，而和室内标准。种子健康测定中，有些病害在田间观察很清楚，而有些则需要室内检验。（如大麦小麦的散黑穗病在田间鉴定很容有些则需要室内检验。（如大麦小麦的散黑穗病在田间鉴定很容易，而检疫室检验则很困难或花费较大。）易，而检

13、疫室检验则很困难或花费较大。）3 3、种子处理、种子处理 通过种子处理，可大大减轻种传病害的发生。如果通过种子通过种子处理，可大大减轻种传病害的发生。如果通过种子健康测定，了解病原菌的感染情况和程度，则可有针对性采取措健康测定，了解病原菌的感染情况和程度，则可有针对性采取措施对种子进行处理，效果更为显著。施对种子进行处理，效果更为显著。五、种子健康检验应注意的问题五、种子健康检验应注意的问题1 1、测定方法、测定方法 种子健康测定的不同方法的敏感性、重演性以及所需培训和设备要求各不相同。 选择种子健康测定方法主要取决于种子种选择种子健康测定方法主要取决于种子种类、病害的种类以及检测的目的。类、

14、病害的种类以及检测的目的。 对于调查、作出种子处理决定或进行田间评定等目的，只需评定种传病菌感染率即可； 对于检疫目的或田间发病率高的种传病菌，对种子样品的检测精度要求很高。 由于病害感染水平与田间发病程度之间没由于病害感染水平与田间发病程度之间没有直接联系，在许多检测方法中，一般不记录有直接联系，在许多检测方法中，一般不记录每粒种子的病原数量。每粒种子的病原数量。五、种子健康检验应注意的问题五、种子健康检验应注意的问题2 2、试验样品的量、试验样品的量 根据测定方法，可把整个送验样品或其中一部分作为试验样品。通常试验样品不得少于400粒净种子，或从送验样品取得相当重量的种子。如有必要，需设定

15、一定数量种子的重复。3 3、结果的计算和报告、结果的计算和报告 结果用供检的样品重量中被感染种子数的百分率或病原体数目表示。填报结果要填报病原菌的学名，同时说明所用的测定方法，并说明用于检查的样品或部分样品的数量。第十八章第十八章 种子健康测定种子健康测定第二节第二节 种子健康测定的检验方法种子健康测定的检验方法（一）试验样品（一）试验样品 根据测定方法的要求，可把整个送验样根据测定方法的要求，可把整个送验样品或其一部分作为试验样品。品或其一部分作为试验样品。 通常试验样品不得少于通常试验样品不得少于400400粒净种子，粒净种子，或从送验样品分取相当重量的种子。或从送验样品分取相当重量的种子

16、。一、种子健康测定的检验方法一、种子健康测定的检验方法一、种子健康测定的检验方法一、种子健康测定的检验方法（二）仪器设备（二）仪器设备 种子健康测定所需的仪器设备因测定种子健康测定所需的仪器设备因测定方法不同而异。方法不同而异。 以测定真菌为例：最基本的仪器设备以测定真菌为例：最基本的仪器设备包括包括双目显微镜双目显微镜( (最好是相差显微镜最好是相差显微镜) )、立体立体显微镜显微镜( (放大放大6060倍，最好带有灯倍，最好带有灯) )、培养箱培养箱( (最最好配置两根近紫外灯管好配置两根近紫外灯管) )、冰箱冰箱、冷冻冰箱、冷冻冰箱、高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅、玻璃容器玻璃容器( (培

17、养皿、烧杯、培养皿、烧杯、烧瓶、载玻片、盖玻片、漏斗等烧瓶、载玻片、盖玻片、漏斗等) )、离心机离心机、摇床、摇床、pHpH值测定仪等。值测定仪等。一、种子健康测定的检验方法一、种子健康测定的检验方法（三）测定方法（三）测定方法1 1、种子健康测定的传统方法、种子健康测定的传统方法 未经培养的检查未经培养的检查 未经培养的检查不能说明病原菌的生活力。主未经培养的检查不能说明病原菌的生活力。主要方法有：要方法有：（1 1）直接检查）直接检查。直接检查。直接检查适用于较大的病原体适用于较大的病原体或杂质外表有明显症状的病害或杂质外表有明显症状的病害，如麦角、线虫瘿、，如麦角、线虫瘿、虫瘿、黑穗病孢

18、子、螨类等。必要时，可应用双虫瘿、黑穗病孢子、螨类等。必要时，可应用双目显微镜、剖粒和软目显微镜、剖粒和软X X射线仪等对试样进行检查，射线仪等对试样进行检查，取出病原体或病粒，称其重量或计算其粒数。取出病原体或病粒，称其重量或计算其粒数。（2 2）吸胀种子检查）吸胀种子检查。吸胀种子检查为使子。吸胀种子检查为使子实体、病症或害虫更容易观察到或促进孢子实体、病症或害虫更容易观察到或促进孢子释放，把试验样品浸入水中或其他液体中，释放，把试验样品浸入水中或其他液体中，种子吸胀后检查其表面或内部，最好用双目种子吸胀后检查其表面或内部，最好用双目显微镜进行观察。显微镜进行观察。（3 3）洗涤物检查。）

19、洗涤物检查。把试验样品浸在加过湿把试验样品浸在加过湿润剂的水里或酒精里，用力振荡，把混在种润剂的水里或酒精里，用力振荡，把混在种子里的或附在种子上的真菌孢子、菌丝和线子里的或附在种子上的真菌孢子、菌丝和线虫等冲洗下来。然后把洗涤液进行过滤、浓虫等冲洗下来。然后把洗涤液进行过滤、浓缩或者蒸发，除去过剩的液体，并用显微镜缩或者蒸发，除去过剩的液体，并用显微镜进行检查提取物。进行检查提取物。一、种子健康测定的检验方法一、种子健康测定的检验方法 生长植株的检查生长植株的检查 将种子培育成植株，然后检查其病症，将种子培育成植株，然后检查其病症，这是测定样品中是否存在细菌、真菌或病毒这是测定样品中是否存在

20、细菌、真菌或病毒等最切实可行的方法。可从供检的样品中等最切实可行的方法。可从供检的样品中取得接种体，以供对健康幼苗或植株一部取得接种体，以供对健康幼苗或植株一部分进行感染试验。严格各种条件，必须防分进行感染试验。严格各种条件，必须防止植株从别处来的次生感染。止植株从别处来的次生感染。一、种子健康测定的检验方法一、种子健康测定的检验方法2 2、真菌检测方法、真菌检测方法 吸水纸法吸水纸法 吸水纸法适用于许多类型种子的种传真吸水纸法适用于许多类型种子的种传真菌病害的检验，尤其是对于许多半知菌，有菌病害的检验，尤其是对于许多半知菌，有利于分生孢子的形成和致病真菌在幼苗上的利于分生孢子的形成和致病真菌

21、在幼苗上的症状的发展。为了促进孢子形成，建议在培症状的发展。为了促进孢子形成，建议在培养期间给以养期间给以1212小时黑暗与小时黑暗与1212小时近紫外光小时近紫外光（NUV)NUV)的交替处理。建议光源使用的交替处理。建议光源使用“黑光黑光”荧光灯荧光灯( (峰值为峰值为360nm)360nm)，不过日光荧光灯管效，不过日光荧光灯管效果也不错。果也不错。一、种子健康测定的检验方法一、种子健康测定的检验方法 琼脂皿法琼脂皿法 主要用于发育较慢的致病真菌潜伏在种主要用于发育较慢的致病真菌潜伏在种子内部的病原菌，也可用于检验种子外表的子内部的病原菌，也可用于检验种子外表的病原菌。病原菌。 发芽法发

22、芽法 可以通过发芽法比较未处理种子的病原可以通过发芽法比较未处理种子的病原体作用和影响。体作用和影响。一、种子健康测定的检验方法一、种子健康测定的检验方法二、细菌测定方法二、细菌测定方法1 1、生长植株鉴定、生长植株鉴定最简单的方法是种植有种传细菌的种子，鉴定幼苗的症状。最简单的方法是种植有种传细菌的种子，鉴定幼苗的症状。2 2、检验室方法、检验室方法检验室测定细菌的方法程序：检验室测定细菌的方法程序：病原体提取病原体提取。提取方法主要有通过浸泡种子，或通过磨。提取方法主要有通过浸泡种子，或通过磨碎或破碎种子并在液体中浸湿等两种方法。种子数量和方碎或破碎种子并在液体中浸湿等两种方法。种子数量和方法应根据试验确定；法应根据试验确定； 分离分离。通过琼脂皿可以将病原细菌从提取后的溶液中。通过琼脂皿可以将病原细菌从提取后的溶液中分离出来，将提取液原液或者稀释液涂在琼脂皿上，可分分离出来，将提取液原液或