PCR技术及习题

1、PCR技术及习题PCR（polymerasechainreaction）:聚合酶链式反应1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核甘酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5端自3端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链。2、PCR反应过程是：变性-复性-延伸类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核甘酸引物。PCR由变性-退火（复性）-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：当温

2、度上升到90c以上时，双链DNA解聚为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：温度下降到50c左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；引物的延伸：72c左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5端向3端延伸。PCR原理示意图IfA奴挂撵版，口口口口口口I口1口口111第一步的9-QN八变性成为单旋第二步!F第一市：引轲。模板互祚恬介引物，绅叫.,mir|第三岁第三步：斑仲,胫成新的双链DMA:1111mmIm口11口”1.；mh口11口口1111111口1t3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次

3、数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。4、细胞被DNA复制与PCR技术的比较:细胞内DNA复制体外DNA扩增（PCR）不同点“旋在解旋酶作用下边解旋边复制80100c高温解旋，双链完全分开DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶，物RNADNA、RNA，度体内温和条件高温相同点需提供DNA模板四种脱氧核甘酸为原料子链延伸的方向都是从5端到3端知识点拨：1、DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80100c时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在5060c左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液，

4、DNA模板、四种脱氧核甘酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。2、PCR的含义是多聚酶链式反应。3、PCR技术反应的条件：稳定的缓冲溶液环境（一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到8.38.8之间）；DNA模板；合成引物（2个）；四种脱氧核甘酸；DNA聚合酶；温控设备4、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。5、TaqDNA聚合酶的特点是：耐高温。主物秀空粒打液rnnornri引物13f一GAACTTTT5GGATCTAGCGTATGC1TGAAA3糙板DNA3CCTAGATCGCATACGAACTTT-55G

5、GAPCTA_31引物2图1PCR引物与模板结合示意图知识拓展：1、DNA聚合酶不能够从头合成DNA,只能从DNA的3端开始延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。2、引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设第3页计互补的寡核甘酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。3、PCR引物设计原则：(1)PCR引物通常长15-25碱基，其中G+C约占50%。(2)引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。(3)引物的3末端必须与目的片段完全相配。(4)引物的5末端可以不与目的片

6、段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列,但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成习题训练1 .聚合酶链式反应(PCR技术)是在实验室中以少量样品DNA制备大量DNA的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4种脱氧核甘酸及ATP等。反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，故DNA数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。循环重复(1)某个DNA样品有1000个脱氧核甘酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4,则经过PCR仪五次循环后，将产生个DNA分子，其中需要提供胸腺喀咤脱氧核甘酸的数量至少是个。(2)分别以不同生物的DNA样品为模板合成的各个新

7、DNA之间存在差异，这些差异是。(3)请指出PCR技术与转录过程的三个不同之处：。2 .通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一第5页技术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因剪刀”能识别的序列和切点是一GGATCC一，请回答:羊小色体片段I铭夫芾院赤白不孽况入伸蛋白质基因礴人铝羊染色体中表跋羊蛋白质基因妣色体上的H他些因力酒的乳中看人体旗白质(1)从羊染色体中剪下”羊蛋白质基因的酶是人体蛋白质基因插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶(2)请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图GGATCC(3)人体蛋白质基因之所以能插入”到羊的染色体内，原因是,“插入”时常用的工具3 .下面甲图中DNA决定某一多肽链中的酪氨酸和丙氨酸过程示意图，乙图示样品DNA经PCR技术(聚合酶链式反应)扩增，可以获取大量DNA克隆分子分析回答：蚩白嗫酷嬴酸丙里酸MI(1)甲图中含有种核甘酸；丙氨酸的遗传密码子是。该图表示了DNA中遗传信息的过程。(2)有一种贫血症是血红蛋白分子的一条多肽链上，一个