Western操作步骤

1、Western-Blot操作流程（一）组织中总蛋白的提取用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200ULRIPA裂解液（含PMSF，比例为97：1：1：1），用杵子研磨3-4min，直至组织完全溶于裂解液（注意：杵子下2/3段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，），|以上过程均在冰上操作。研磨好组织后均在振荡机上振荡20-30S,每隔5min再次振荡，重复3次。然后在4°C下12000rpm离心5min，取上清分装于1.5mlEP管中并置于-80°C冰箱保存。（二）BCA法蛋白含量的测定（1）从-20C取出1mg/mlBSA，室温融化

2、后，备用。（2）取96孔板，按以下表格分别加入相关试剂：PBS(uL)+BSA(uL)40+038+236+432+824+1616+248+320+40PBS(uL)+样本(uL)39+139+139+139+139+139+139+139+1注意：加不同的样本时注意更换枪头以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200ULBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37C水浴锅30min后取出。酶标仪测定OD值。（5）EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。（三）稀释蛋白及蛋白变性如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释

3、（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100C的干式恒温器中加热5-10min，使蛋白变性。（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20°C冰箱保存。（四）制作SDS电泳胶清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板配置10%的分离胶配方：H2O24.0ml30%丙烯酰胺液3.3ml1.5mol/lTriS(PH8.8)2.5ml10%SDS100ul10%过硫酸胺100ulTEMED4ul分离胶溶液中加入TEMED以及10%过硫

4、酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约lcm处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。制备5%的浓缩胶配方；H2O23.4ml30%丙烯酰胺液0.83ml1.5mol/lTriS(PH6.8)0.63ml10%SDS50ul10%过硫酸胺50ulTEMED5ul将所剩余空间加满浓缩胶，迅速将梳子插入浓缩胶中，室温放置约10min,待浓缩胶凝固后，轻轻将梳子拔出。（梳子也可在电泳液中拔出）（五）SDS-PAGE电泳（1）按厂家说明组装好电泳槽，在电泳槽中加满电泳液后开始上样（上样枪上样）；将准备好的蛋白样品和预染的蛋白质分子量标准

5、品分别上样，注意切勿将样品溢出孔外。（注意：样品的准备：每孔配制含50憾总蛋白的样品，按照组织中目的蛋白含量的多少调整上样量）（2）接通电源开始电泳；0V恒定电压下电泳30min,然后改为140V恒定电压电泳1小时；待溴酚蓝条带至凝胶底端时停止电泳。（六）转膜（1）小心的从玻璃板上取下凝胶，切除所有浓缩胶及最下端的溴酚蓝条带（注意动作轻柔，保证凝胶的完整性）。将凝胶转移至转膜液中浸泡约15min;同样，滤纸在转膜液中浸泡至少30s；准备好的硝酸纤维素膜（NC膜）浸入转膜液中15min。（2）制备夹层“三明治”：按照下列顺序排列：海绵垫滤纸凝胶NC膜滤纸海绵垫，注意要逐层排放，每层需要排空气泡，

6、以免影响转膜效率。（3）将已经做好的“三明治”夹子放入转移槽中，使黑色面对准电泳槽的黑色面;由于转膜时会产生大量热量，在电泳槽周围需要放置冰壶用以降温。将转移装置置于冰中，打开电源，调节电压至100v，转膜时间90min。（七）显色和剪膜转完后将膜用1X丽春红染液染至可以看到蛋白条带，将膜放入TBST液体中，对照蛋白maker条带用直尺标出目的蛋白的范围并剪下，将丽春红染液洗净，膜晾干备用。（八）膜的免疫反应（1）封闭：将晾干的膜移至含有封闭液（5%脱脂奶粉）的平皿中，室温下脱色摇床封闭1-2小时。（2）倒掉封闭液，附上一抗，用保鲜膜裹在平皿上，置于4°C冰箱过夜。（3）第二天将平皿

7、置于摇床上摇15-30min,将一抗回收,TBST液洗膜3次，每次5min;随后加入HRP标记的二抗，室温摇床上孵育1小时;紧接着回收二抗，用TBST洗膜3次，第一次10min,随后两次各5min。（九）化学发光、显影、定影（1）准备工作：将化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液（注意避光）。（2）将洗涤好的NC膜置于反应液中室温孵育1-3min（避光）。（3）去除过量的溶液，将膜夹在两层保鲜膜之间，X胶片曝光，根据荧光强度决定曝光时间（过程中注意避光）。WesternBlot整个操作流程中所用试剂生产厂家及编号RIPA裂解液（中）BeyotimeP0013CPhosphataseInhi

8、bitorCooktallKANGCHENKC-440.2BSA蛋白标准品（5mg/ml）BeyotimeP0012-3P0012P0015LBCA蛋白浓度测定试剂盒（A、B两盒）Beyotime蛋白上样缓冲液（SDS-PAGE）（5*15ml）Beyotime30%丙烯酰胺液（100ml）BeyotimeST0031MTris-Hcl（100ml）Ph8.8BeyotimeST7881MTris-Hcl（100ml）Ph6.8BeyotimeST76810%SDS（100ml）BeyotimeST628TEMEDBeyotimeST728APS粉末（AmmoniumPersulfate）生工生物工程（上海）股份有限公司（SangonBiotech）A1004860025Tris碱（500g）Glycine（500g）SangonBiotechSangonBiotechA1008260500A1001670500SDS粉剂SangonBiotechA100227010020*TBSConcentrate（500ml）SangonBiotechB548105-0500Tween-20SangonBiotechA1007770500蛋