第十三章 分光光度法2016.10基础化学

1、第十三章第十三章可见分光光度法和紫外分光光度法可见分光光度法和紫外分光光度法 1.光的性质及物质对光的选择性吸收光的性质及物质对光的选择性吸收(了解了解)2. 分光光度法的基本原理分光光度法的基本原理, Lambert-Beer 定律及定律及有关计算有关计算(掌握掌握)3. 分光光度计的基本构造分光光度计的基本构造, 熟悉标准曲线法熟悉标准曲线法(了解了解)4. 提高测量灵敏度和准确度的方法提高测量灵敏度和准确度的方法(了解了解)5. 紫外分光光光法的一般概念紫外分光光光法的一般概念(了解了解) 本章内容本章内容分光光度法的基本原理及分光光度法的基本原理及Lambert-Beer 定律定律可见

2、分光光光法的测量方法。可见分光光光法的测量方法。-重点重点分光光度法分光光度法（spectrophotometry) 定义：根据物质的定义：根据物质的吸收光谱吸收光谱及及光的吸收定律光的吸收定律对物对物质进行定性、定量质进行定性、定量分析分析的一种的一种方法方法原理：原理： 吸收光谱吸收光谱 物质结构的内部特征物质结构的内部特征定量分析：确定某一成份或某一化合物定量分析：确定某一成份或某一化合物存在多少存在多少定性分析：确定某一成份某一化合物定性分析：确定某一成份某一化合物是否存在是否存在分光光度法的分类分光光度法的分类光源波长范围光源波长范围( nm) 类型类型 380780 可见分光光度法

3、可见分光光度法200380 紫外分光光度法紫外分光光度法 7803105 红外分光光度法红外分光光度法分光光度法特点：分光光度法特点： 灵敏度高灵敏度高: 10-510-6mol/L最低浓度最低浓度 准确度较高准确度较高 操作简便、快速操作简便、快速 应用广泛应用广泛分光光度法的应用分光光度法的应用例：阿司匹林（乙酰水杨酸）片剂中水杨例：阿司匹林（乙酰水杨酸）片剂中水杨酸的鉴别酸的鉴别 阿司匹林易吸收空气中的水份而水解产生阿司匹林易吸收空气中的水份而水解产生水杨酸，而水杨酸容易刺激胃。国家药监局规水杨酸，而水杨酸容易刺激胃。国家药监局规定：水杨酸的含量定：水杨酸的含量 0.10.1紫外分光光度

4、法，在紫外分光光度法，在max=312nm 处进行处进行测定测定例例2： 紫外分光光度法广泛用于生物试样中紫外分光光度法广泛用于生物试样中蛋白质蛋白质（max=280 nm ），），核酸核酸的纯度分析的纯度分析（max=260 nm ）例例3： 食品食品(果酱果酱、果汁果汁、肉制品肉制品)中苯甲酸盐中苯甲酸盐、山梨酸盐含量的测定山梨酸盐含量的测定 山梨酸盐等常用作山梨酸盐等常用作食品添加剂食品添加剂以抑制酵母和霉菌以抑制酵母和霉菌的生长的生长,食品工业上对其用量一般有严格限定食品工业上对其用量一般有严格限定(如：果如：果酱酱 0.1 ) 苯甲酸盐的石油醚溶液苯甲酸盐的石油醚溶液(max=225

5、 nm )处有最大处有最大吸收峰；山梨酸盐的石油醚溶（吸收峰；山梨酸盐的石油醚溶（max=250nm ）处有）处有最大吸收峰。最大吸收峰。 第一节第一节 物质的吸收光谱物质的吸收光谱1、光的基本性质、光的基本性质光是一种电磁波，具有波光是一种电磁波，具有波 粒二象性。粒二象性。 光的波长（光的波长（）、频率（）、频率（）与速度（）与速度（c）的关系如下：的关系如下： E=h=h c/ c 波长短，能量大，穿透力强；波长长，波长短，能量大，穿透力强；波长长，能量小，穿透力弱。能量小，穿透力弱。一、物质对光的选择性吸收一、物质对光的选择性吸收 2. 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收物质对光

6、的吸收具有选择性物质对光的吸收具有选择性例：石英例：石英 可见光可见光 几乎不吸收几乎不吸收 光学光学：物质对光的吸收是物质的普遍性质物质对光的吸收是物质的普遍性质 红外光红外光 强烈吸收强烈吸收 物质对光的吸收是物质物质对光的吸收是物质(分子、原子、离子分子、原子、离子等等)与辐射能相互作用的一种形式，只有当入射与辐射能相互作用的一种形式，只有当入射光的光的能量能量同吸光物质的同吸光物质的基态基态和和激发态激发态能量差能量差相相等时才会被吸收等时才会被吸收物质对光的吸收物质对光的吸收： E = 光子能量光子能量(h) M (基态基态) + h M (激发态激发态) 2. 物质对光的选择性吸收

7、物质对光的选择性吸收 物质呈现的颜色与光有着密切的关系，不同物质呈现的颜色与光有着密切的关系，不同波长的可见光可使眼睛感觉到不同的颜色。波长的可见光可使眼睛感觉到不同的颜色。可见光可见光各种颜色光有波长范围各种颜色光有波长范围紫外紫外紫紫 蓝蓝 青青 绿绿黄黄 橙橙红红红外红外400450 480 500560 600650760800nm3.3.物质颜色与吸收光的关系物质颜色与吸收光的关系单色光：具有单一波长的光单色光：具有单一波长的光复合光：由不同波长光组成的光复合光：由不同波长光组成的光白光（日光、白炽灯光等）：由不同颜色的白光（日光、白炽灯光等）：由不同颜色的 光按一定强度比例混合而成

8、光按一定强度比例混合而成互补色光：两种颜色的光按适当的强度互补色光：两种颜色的光按适当的强度比例混合可成白光，则这两种光互称为比例混合可成白光，则这两种光互称为三个概念三个概念物质对光的吸收物质对光的吸收有选择性有选择性 溶液对溶液对各种色光各种色光不吸收不吸收全吸收全吸收 溶液溶液的颜色的颜色 溶液选择吸收了某种颜色的光，则溶液选择吸收了某种颜色的光，则溶液呈现吸收光的溶液呈现吸收光的互补色光互补色光的的颜色颜色无色透明无色透明 黑色黑色图示： CuSO4溶液呈蓝色溶液呈蓝色复合光复合光 黄色光被吸收黄色光被吸收 溶液呈蓝色溶液呈蓝色 硫酸铜溶液硫酸铜溶液 红红橙橙黄黄绿绿青青青蓝青蓝蓝蓝紫

9、紫对角上的颜色对角上的颜色 称为称为互补色光互补色光物质的颜色与物质的颜色与 吸收光颜色为吸收光颜色为 互补色光互补色光 物质颜色与吸收光颜色的关系物质颜色与吸收光颜色的关系白光白光物质的颜色和其吸收光颜色的关系物质的颜色和其吸收光颜色的关系物质的颜色物质的颜色吸收光吸收光颜色颜色黄绿黄绿黄黄橙橙红红紫红紫红紫紫蓝蓝绿蓝绿蓝蓝绿蓝绿黄绿黄绿黄黄橙橙红红紫紫蓝蓝绿蓝绿蓝蓝绿蓝绿绿绿/nm400450450480480490490500500560560580580600600650650760吸收光谱吸收光谱(吸收曲线吸收曲线) ( absorption spectrum)图图12-3 不同波长

10、不同波长KMnO4溶液吸收光谱溶液吸收光谱 当浓度改变时当浓度改变时max位置不变位置不变 (525nm)物质种类物质种类 max A C 0.20.40.60.8400450500波长波长55060065020mgL 40mgL 60mgLnmA二、物质的吸收光谱二、物质的吸收光谱 ？定性分析：定性分析：由于不同物质结构不同，因此，吸由于不同物质结构不同，因此，吸 收的紫外光收的紫外光波长波长也不同，利用这一也不同，利用这一 性质可以性质可以鉴别鉴别物质。物质。定量测定：定量测定：同一物质的稀溶液，浓度大的吸光度同一物质的稀溶液，浓度大的吸光度 的值较大，反之则较小，利用这一性的值较大，反之

11、则较小，利用这一性 质可进行定量测定。质可进行定量测定。max是定性分析的依据是定性分析的依据 A 是定量分析的依据是定量分析的依据第二节第二节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理一、透光率和吸光度一、透光率和吸光度图图13-3 光通过溶液的情况光通过溶液的情况I0ItbI0 = Ia + It + IrI0 = Ia + ItIrIaT ItI0T:透光度透光度(transmittance) 或百分透光率或百分透光率( T%) A:吸光度吸光度 (absorbance) A= -lgT = lgI0It二、朗伯二、朗伯-比尔定律（光吸收定律）比尔定律（光吸收定律） Lambert-Beer

12、定律定律I0ItbLambert定律定律：A= k1bA=bcBeer定律定律： A= k2c Lambert-Beer定律定律： T= 10-bcA= -lgT图图13-3 光通过溶液的情况光通过溶液的情况 公式适用范围公式适用范围 单色光单色光 均匀溶液均匀溶液(稀溶液稀溶液) 气相、均相固体气相、均相固体 可见光区，紫外、红外区可见光区，紫外、红外区 式中式中b的单位的单位cm c为物质的量浓度，单位为为物质的量浓度，单位为mol L-1 称为摩尔吸光系数称为摩尔吸光系数 单位单位: L mol-1cm-1A = -lgT = -lg It /I0 =bc 若用质量浓度若用质量浓度(g

13、L-1)代替物质的量浓代替物质的量浓度度c，则，则A = a b a为质量为质量吸光系数吸光系数 单位单位 L . g-1.cm-1 = a MBA = bc (a)：衡量吸光光度法的灵敏度：衡量吸光光度法的灵敏度 是有色物质的是有色物质的特征常数特征常数 (或或 a )值说明：值说明：. . . .与与c、b无关无关与与 入射光波长入射光波长 物质本性物质本性溶剂，温度溶剂，温度有关有关; 测定时，取测定时，取max，值最大值最大,显色反应最显色反应最灵敏（灵敏（104105） 测定使用的测定使用的值，如不特别注明，通常值，如不特别注明，通常指在指在max条件下测定的条件下测定的 化合物组成

14、不明，物质的相对分子质量化合物组成不明，物质的相对分子质量( M )不知道，物质的量的浓度无法确定，不知道，物质的量的浓度无法确定，无法使用摩尔吸光系数无法使用摩尔吸光系数( () ) 医学上常用医学上常用比吸光系数比吸光系数E1cm 1 % 符号：符号：比吸光系数比吸光系数（specific absorptivity)E1%表示表示单位：单位：mLg-1.cm-1 与与关系：关系：时的吸光值时的吸光值浓度浓度: 1%(gmL-1) b: 1cm1cmE1% = 101cmMB 与与 a关系：关系：a = 0.1 E1%1cm三、吸收度的加和性三、吸收度的加和性内容内容： 多组分体系中多组分体

15、系中(a,b,c, )，在某一波，在某一波长长()，如果各种对光有吸收的物质之间没有，如果各种对光有吸收的物质之间没有相互作用，则体系在该波长的相互作用，则体系在该波长的总吸光度总吸光度等于等于各组分吸光度之和各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性。，即吸光度具有加和性。 表示式表示式： A总总Aa + Ab + Ac +分光光度法中分析测定混合物中各组分分光光度法中分析测定混合物中各组分的依据的依据 意义意义 四、相关计算四、相关计算1. A = -lgT = -lg It /I0 = bc2. a = a MBa =0.1E1cm 1 % E1cm 1 % E1cm 1 % = 10/ MB

16、例例1：已知：已知Fe2+ ：500gL-1 b：2 cm A：0.19 (508nm）求求?解：解：c(Fe2+) = 8.910-6molL-1A=bc50010-655.85=Abc=1.1104 (Lmol-1cm-1)= 0.19 / (28.910-6)例例13-1：教材：教材P252 已知某化合物的相对分子质量为已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmolL-1的溶液，在的溶液，在480nm波波长处用长处用2.00cm吸收池测得透光率为吸收池测得透光率为39.8 ，求该化合物，求该化合物在上述条件下的在上

17、述条件下的摩尔吸光系数摩尔吸光系数和和质量吸光系数质量吸光系数a ？=Abc解解:已知已知 c0.150 10-3molL-1b2.00cm，T0.398代入公式代入公式: = lg 0.398 (1.50 10-4molL-12.00cm )a =M = 1.33 103 L mol -1 cm -1据公式据公式:= 1.33 103 251= 5.30 L g-1 cm-1例例13-1：教材：教材P252 已知某化合物的相对分子质量为已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmolL-1的溶液，在的溶液，在480nm波

18、波长处用长处用2.00cm吸收池测得透光率为吸收池测得透光率为39.8 ，求该化合物，求该化合物在上述条件下的在上述条件下的摩尔吸光系数摩尔吸光系数和和质量吸光系数质量吸光系数a ？小结： 2. Lambert-Beer定律定律A = -lgT = -lg It /I0 = bcE1cm 1 % 三个吸光系数：三个吸光系数：a 1.物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收第三节第三节 可见可见分光光度法分光光度法 (spectrophotometry) 原理和特点原理和特点原理：根据原理：根据Lambert-Beers law白光白光单色光单色光有色溶液有色溶液 A值值求被测物含量求被测物含量一、

19、分光光度计一、分光光度计( spectrophotometer) 主要部件主要部件1、光源光源：钨丝灯（：钨丝灯（3203200nm） 稳定，足够光强度稳定，足够光强度2、单色器单色器：获取单色光：获取单色光 棱镜或光栅棱镜或光栅 3、吸收池吸收池：比色皿（石英、玻璃）：比色皿（石英、玻璃） 4、 检测器检测器： 光电管光电管5、讯号处理及显示器讯号处理及显示器：指针式微安表：指针式微安表图图13-4 (b) 混合光在棱镜中的色散混合光在棱镜中的色散6006002、单色器、单色器准直镜准直镜棱镜棱镜出光狭缝出光狭缝入光狭缝入光狭缝白光白光入光狭缝入光狭缝准直镜准直镜棱镜或光栅棱镜或光栅 色散后

20、的光色散后的光准直镜准直镜出光狭缝出光狭缝 转动棱镜或光栅转动棱镜或光栅 出光狭缝处获出光狭缝处获单色光单色光图图13-4 (a) 单色器示意图单色器示意图2、单色器、单色器4、检测器、检测器 ：光电管光电管两极间加电压，线路中产生电流两极间加电压，线路中产生电流光电流大小与照射光强度成正比光电流大小与照射光强度成正比 光电管工作线路示意图光电管工作线路示意图光光 光敏阴极光敏阴极 阴极表面放电子阴极表面放电子入射光入射光放大器放大器记录器记录器+-阳极阳极阴极阴极(光敏材料如氧化铯光敏材料如氧化铯)高电阻高电阻5、指示器、指示器图图13-5 吸光度与透光率标尺吸光度与透光率标尺2.0 1.00.7 0.6 0.50.40.30.2 0.15 0.10.050 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100AT(%)-721型分光