基因工程的基本步骤

1、 基因工程的基本操作程序一、目的一、目的基因基因的获取的获取二、二、基因表达基因表达载体的构建载体的构建三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定第1页/共76页基因:有遗传效应的DNA片段 基因的分布,成分,结构,功能与DNA一致染色体染色体基因基因思考：什么是基因思考：什么是基因? 基因与的关系基因与的关系 基因与染色体的关系基因与染色体的关系回忆旧知识：回忆旧知识： 基因的基本功能是什么？基因的基本功能是什么？第2页/共76页1 1、通过复制，在后代的传种接代中、通过复制，在后代的传种接代中传递传递遗传信息遗传信息2 2、在后代的

2、个体发育过程、在后代的个体发育过程中，使中，使遗传信息得以表达遗传信息得以表达，控制生物的性状控制生物的性状 DNADNA（基因）的基本功能（基因）的基本功能DNA中碱基对(或脱氧核苷酸)的排列顺序第3页/共76页时间时间场所场所过程过程模板模板原料原料能量，酶能量，酶产物产物特点特点有丝分裂间期或减数分裂间期有丝分裂间期或减数分裂间期主要在细胞核，少数在线粒体、叶主要在细胞核，少数在线粒体、叶绿体；原核绿体；原核细胞的拟核区细胞的拟核区DNADNA分子两条单链（称为母链）分子两条单链（称为母链）四种游离的脱氧核苷酸四种游离的脱氧核苷酸ATPATP；DNADNA解旋酶、聚合酶等解旋酶、聚合酶等

3、子代子代DNADNA分子分子( (与亲代一模一样与亲代一模一样) )边解旋边复制、半保留复制边解旋边复制、半保留复制 ； 一一.的复制的复制解旋解旋合成合成复旋复旋有的是多起点复制有的是多起点复制第4页/共76页第5页/共76页转录：在细胞核内，以转录：在细胞核内，以DNADNA的一条链的一条链为模板，按照为模板，按照碱基互补配对的原则碱基互补配对的原则合合成成RNARNA的过程的过程。（一）（一）转录转录二二.基因的表达基因的表达:基因指导蛋白质的合成基因指导蛋白质的合成 第6页/共76页TCATG T TT AAG T AC A A A T DNADNA的平面结构图的平面结构图第7页/共7

4、6页AG T AC A A A T AGCUGACGGUUUDNADNA单链单链游离游离的核的核糖核糖核苷酸苷酸以以DNADNA的一条链为模板合成的一条链为模板合成RNARNA第8页/共76页RNA 聚合酶聚合酶AG T AC A A A T AGCUGACGGUUU DNADNA与与RNARNA的碱基互补配对：的碱基互补配对：AUAU；CC；CGCG；TATADNADNA单链单链第9页/共76页AG T AC A A A T AGCGACGGUUUU 组成组成 RNA 的核糖核苷酸一个个连接起来的核糖核苷酸一个个连接起来DNADNA单链单链第10页/共76页AG T AC A A A T A

5、GCGACGGUUUU 组成组成 RNA 的核糖核苷酸一个个连接起来的核糖核苷酸一个个连接起来DNADNA单链单链第11页/共76页AG T AC A A A T GCGACGGUUU UA 组成组成 RNA 的核糖核苷酸一个个连接起来的核糖核苷酸一个个连接起来DNADNA单链单链第12页/共76页AG T AC A A A T GCGACGUUGU UA 组成组成 RNA 的核糖核苷酸一个个连接起来的核糖核苷酸一个个连接起来DNADNA单链单链第13页/共76页AG T AC A A A T GCGACGUGU UAU 组成组成 RNA 的核糖核苷酸一个个连接起来的核糖核苷酸一个个连接起来D

6、NADNA单链单链第14页/共76页AG T AC A A A T GCGACGGU UAU U 组成组成 RNA 的核糖核苷酸一个个连接起来的核糖核苷酸一个个连接起来DNADNA单链单链第15页/共76页AG T AC A A A T GCGACGGU UAU UA 组成组成 RNA 的核糖核苷酸一个个连接起来的核糖核苷酸一个个连接起来DNADNA单链单链第16页/共76页AG T AC A A A T GCGCGGU UAU UA U 组成组成 RNA 的核糖核苷酸一个个连接起来的核糖核苷酸一个个连接起来DNADNA单链单链第17页/共76页AG T AC A A A T GGCGGU U

7、AU UA U C 组成组成 RNA 的核糖核苷酸一个个连接起来的核糖核苷酸一个个连接起来DNADNA单链单链第18页/共76页AG T AC A A A T GGCGGU UAU UA U C结果结果: :形成的形成的 mRNAmRNA链上链上, ,具有了特定的碱基序列，即具有了特定的碱基序列，即DNADNA上的遗传信息传递到了上的遗传信息传递到了mRNAmRNA上上mRNAmRNADNADNA单链单链第19页/共76页AG T AC A A A T UCAUG A UUAmRNA 细胞核细胞核 核孔核孔DNAmRNAmRNA在细胞核中合成在细胞核中合成 细胞质细胞质第20页/共76页AG

8、T AC A A A T UCAUG A UUAmRNA 细胞核细胞核DNAmRNAmRNA在细胞核中合成在细胞核中合成 细胞质第21页/共76页AG T AC A A A T UCAUG A UUAmRNA 细胞核细胞核DNAmRNAmRNA在细胞核中合成在细胞核中合成 细胞质第22页/共76页AG T AC A A A T UCAUG A UUAmRNA 细胞核细胞核DNAmRNAmRNA在细胞核中合成在细胞核中合成 细胞质第23页/共76页AG T AC A A A T UCAUG A UUAmRNA 细胞核细胞核DNAmRNAmRNA在细胞核中合成在细胞核中合成 细胞质第24页/共76

9、页AG T AC A A A T UCAUG A UUAmRNA 细胞核细胞核DNAmRNAmRNA在细胞核中合成在细胞核中合成 细胞质第25页/共76页AG T AC A A A T UCAUG A UUAmRNA 细胞质 细胞核细胞核DNAmRNA在细胞核中合成第26页/共76页基因的表达（二）基因的表达（二）翻译翻译密码子密码子mRNAmRNA上决定一个氨基酸的上决定一个氨基酸的3 3个相邻的个相邻的碱基碱基密码子的位置密码子的位置密码子的组成密码子的组成密码子的作用密码子的作用mRNAmRNA上上3 3个相邻的碱基个相邻的碱基决定一个氨基酸决定一个氨基酸mRNAmRNA怎样控制蛋白质的

10、合成？怎样控制蛋白质的合成？mRNAmRNA的的碱基序列碱基序列( )( )决定决定蛋白质的蛋白质的氨基酸氨基酸序列序列密码子密码子思考思考: :第27页/共76页AUU氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基氨基酸酸tRNA:转运转运RNA 可以专一地识别并搬运一种氨基酸可以专一地识别并搬运一种氨基酸问题：问题： 氨基酸是怎样被运送到核糖体的？氨基酸是怎样被运送到核糖体的？氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸第28页/共76页AUAGGAGAAAGAUUAUUAUUmRNA问题：问题： 氨基酸是怎样被运送到核糖体的？氨基酸是怎样被运送到核糖体的？AUUAUUAUU密码子和反密码子和反密码子之间密码子之间

11、按照碱基互按照碱基互补配对原则补配对原则,氨基酸正确氨基酸正确排序排序密码子密码子反密码子反密码子第29页/共76页AUUCCUAUAGGAGAUUGUUAUAAUAUUAUUCCUCCUmRNA核糖体第30页/共76页AUUCCUAUAGGAGAUUGUUAUAAUCCACCACCA第31页/共76页CCUAUAGGAGAUUGUUAUAAUCCAACAACAACA第32页/共76页AUAGGAGAUUGUUAUAAUCCAACAAUAAUAAUA第33页/共76页AUAGGAGAUUGUUAUAAUACAAUAUUAUUAUUA第34页/共76页AUAGGAGAUUGUUAUAAUAUAU

12、UA第35页/共76页AUAGGAGAUUGUUAUAAUUUA第36页/共76页AUAGGAGAUUGUUAUAAU多肽多肽第37页/共76页规律规律: :决定蛋白质中的一个氨基酸决定蛋白质中的一个氨基酸, ,需需mRNAmRNA中中_至少个碱基至少个碱基; ;需需DNADNA中中_至少个碱基至少个碱基. .DNA(双链双链):mRNA(单链单链):蛋白质蛋白质:碱基碱基氨基酸氨基酸1个个3个个6个个遗传信息遗传信息遗传密码遗传密码AA序列序列碱基碱基第38页/共76页外显子外显子内含子内含子与RNA聚合酶结合位点编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点编码区原核生物基因

13、原核生物基因真核生物基因真核生物基因基因的结构基因的结构第39页/共76页第40页/共76页基因组文库基因组文库部分基因文库如：部分基因文库如：第41页/共76页2 2、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库 基因组文库部分基因文库(CDNA文库)第42页/共76页某生物体内全部某生物体内全部DNA DNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受

14、体菌群体2 2、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因限制酶与运载体连接与运载体连接 导入导入基因组文库基因组文库某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNAcDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接与运载体连接 导入导入部分基因文库部分基因文库（cDNAcDNA文库）文库）第43页/共76页第44页/共76页根据目的基因的有关信息，如：根据目的基因的有关信息，如：基因的已知核苷酸序列；基因的已知核苷酸序列；基因的功能；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因在染色体上的位置；基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA；基因的表达产物蛋白质；基因的表达产物

15、蛋白质； 第45页/共76页基因组文库基因组文库部分基因文库如：部分基因文库如：聚合酶链式反应聚合酶链式反应第46页/共76页3 3、利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。因。第47页/共76页循环循环变性变性退火退火延伸延伸第48页/共76页 DNA母链母链4种种脱氧核苷酸DNA聚合酶聚合酶引物引物温度控制温度控制1）模板：）模板：2）原料：）原料：3）酶：）酶：DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸解

16、旋酶解旋酶DNADNA聚合酶聚合酶等等4 4）特点）特点: :半保留复制半保留复制边解旋边复制边解旋边复制半保留复制半保留复制全解旋再复制全解旋再复制第49页/共76页复制原点+启动子+目的基因+终止子+标志基因基因表达载体的组成v 基因表达载体的构建-核心第50页/共76页基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端第51页/共76页 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌

17、、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。将目的基因导入受体细胞-转化第52页/共76页（三）导入方法（三）导入方法1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法农杆菌转化法农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞-转化第53页/共76页第54页/共76页胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第55页/共76页第56页/共76页第57页/共76页1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细

18、胞显微注射技术提纯基因表达载体提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植（三）导入方法将目的基因导入受体细胞-转化第58页/共76页1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理增大细菌细胞壁的通透性（三）导入方法将目的基因导入受体细胞-转化第59页/共76页抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等)第60页/共76页第61页/共76页，第62页/共76页基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序目的

19、基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1 1、化学方法人工合成化学方法人工合成2 2、从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因3 3、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因复制原点复制原点 + + 目的基因目的基因 + + 启动子启动子 + + 终止子终止子 + + 标记基因标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原分子杂交技术、

20、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定第63页/共76页巩固练习:1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该抗性基因的主要作用是 ( )A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入进行检测C.增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接2.在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于 ( )A.目的基因的提取和导入B.目的基因的提取和检测C.目的基因与载体的结合和导入D.目的基因的提取与载体结合BD第64页/共76页3.在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得 ( )A.人的胰岛素基因 B.蚕的蚕丝蛋白基因C.芽孢杆菌的抗虫基因 D.菜豆储藏蛋白基因4.1976年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达,此文中的表达是指该基因在大肠杆菌 ( )A.能进行DNA复制B.能传递给细菌后代C.能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素CC第65页/共76页5.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的,在基因操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是 ( )A.人工合成目的基因B.目的基因与