琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法学习教案

1、会计学1琼脂糖凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳技术(jsh)的原理和方的原理和方法法第一页，共21页。第1页/共21页第二页，共21页。（1）某物质在电场作用）某物质在电场作用(zuyng)下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。核酸分子大小和构型有关。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用(zuyng)下向正极泳动。下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的分离

2、大小不同的DNA或或RNA分子。分子。（2 2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成(xngchng)(xngchng)具有刚性的滤孔，具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。就越强。第2页/共21页第三页，共21页。 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNADNA分子大小来确定。琼脂糖是一种分子大小来确定。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨(

3、fnbin)(fnbin)能力就越强。能力就越强。（3 3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EBEB可与可与DNADNA分子形成分子形成EB-DNAEB-DNA复合物，其荧光强度与复合物，其荧光强度与DNADNA的含量成正比。据此可判断的含量成正比。据此可判断DNADNA分子量大小分子量大小(dxio)(dxio)和粗略估计样品和粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。 表表1 1 琼脂糖凝胶的浓度琼脂糖凝胶的浓度(nngd)(nngd)与与DNADNA分子大小的关系分子大小的关系第3页/共21页第四页，共21页。第4页/共21页第五页

4、，共21页。DYY-6CDYY-6C型型 双稳定时电泳仪电源（北京双稳定时电泳仪电源（北京(bi jn)(bi jn)六一）六一） 输出范围（显示分辨率）：输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V) 4-400mA(1mA)240W6-600V(1V) 4-400mA(1mA)240W美国美国Bio-radBio-rad伯乐伯乐 小型小型(xioxng)(xioxng)水平电泳槽水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell Mini-Sub Cell GT Cell 第5页/共21页第六页，共21页。第6页/共21页第七页，共21页。一个已知分子质量的一个已知分子质量的DNADNA样

5、品做最对照样品做最对照(duzho)(duzho)，用，用来确定待测样品的相对分来确定待测样品的相对分子质量。子质量。第7页/共21页第八页，共21页。4.4.常用常用(chn (chn yn)yn)电泳缓冲液电泳缓冲液高度复杂高度复杂DNADNA混混合物；超螺旋合物；超螺旋DNADNA 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般(ybn)(ybn)与蔗糖、甘油或聚蔗糖与蔗糖、甘油或聚蔗糖400400组成上样组成上样缓冲液。作用：缓冲液。作用：增加样品比重，以确保增加样品比重，以确保DNADNA均匀沉入加样孔内。均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，

6、预测核酸电泳的速度和位置。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。使样品呈色，使加样操作更方便。5.上样缓冲液上样缓冲液第8页/共21页第九页，共21页。4.4.常用核酸常用核酸(h sun)(h sun)染料染料名称名称优点优点缺点缺点 EB （溴化乙锭）（溴化乙锭）染色操作简便，快速，室温下染色操作简便，快速，室温下15-2015-20minmin；不会使核酸断裂；不会使核酸断裂；灵敏度高，灵敏度高，1010ngng或更少的或更少的DNADNA即可检出；可以加到样品中或即可检出；可以加到样品中或胶中。胶中。 EB EB是诱变剂，使用时是诱变剂，使用时一

7、定要戴手套。一定要戴手套。 EBEB废废液要经过处理才能丢弃。液要经过处理才能丢弃。Gldview 低毒，灵敏度较高的染料；低毒，灵敏度较高的染料；可以加入样品中。可以加入样品中。dsDNAdsDNA呈现呈现绿色荧光绿色荧光, ,而而ssDNAssDNA呈红色荧光呈红色荧光, ,能较好地区分能较好地区分dsDNAdsDNA与与ssDNAssDNA。 价格稍高，灵敏度价格稍高，灵敏度 较较低。背景强烈。低。背景强烈。SYBR新型低毒，高灵敏度染料，可新型低毒，高灵敏度染料，可以加入样品中。以加入样品中。 价格昂贵。对小于价格昂贵。对小于50 bp染色缺失，小于染色缺失，小于100的染色效果较差。

8、稳定的染色效果较差。稳定性差性差GenefinderGenefinder 花青类染料花青类染料,毒性很低；最大吸收毒性很低；最大吸收峰为峰为 470nm。具有安全、灵敏、。具有安全、灵敏、经济的特点经济的特点 重复性较差。能引起重复性较差。能引起有机体突变。有机体突变。第9页/共21页第十页，共21页。第10页/共21页第十一页，共21页。1.1.制备琼脂糖制备琼脂糖凝胶（凝胶（1%1%）2.2.制备凝胶板制备凝胶板3.3.加样加样4.4.电泳电泳 5.5.染色染色(rns)(rns)6.6.结果观察结果观察 四四. .实验实验(shyn)(shyn)步骤步骤第11页/共21页第十二页，共21

9、页。胶板设计胶板设计(shj)（27人）：人）：每每11孔胶板（孔胶板（4人：人：2样品样品+1marker）。）。第12页/共21页第十三页，共21页。5l质粒质粒DNA+1l loading buffer 混混匀；匀；15lPCR产物产物(chnw)+3l loading buffer，混匀；，混匀；10l酶切产物酶切产物(chnw)+2l load- ingbuffer混匀；混匀；5l DNA Marker(每板胶一孔）每板胶一孔）2.加样加样第13页/共21页第十四页，共21页。3.电泳电泳(din yn)电压电压3-5V/cm，约，约80-90V，注意电极，注意电极(dinj)方向方

10、向第14页/共21页第十五页，共21页。4.观察观察(gunch)紫外透射紫外透射(tu sh)分析仪下观察。分析仪下观察。第15页/共21页第十六页，共21页。第16页/共21页第十七页，共21页。第17页/共21页第十八页，共21页。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖链依分子琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖链依分子(fnz)(fnz)内和分子内和分子(fnz)(fnz)间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 琼脂糖凝胶结构琼脂糖凝胶结构(ji

11、gu)(jigu)形成形成过程过程 琼脂糖单糖琼脂糖单糖(dn tn)(dn tn)分子分子结构结构 琼脂糖粉形成琼脂糖凝胶的过程琼脂糖粉形成琼脂糖凝胶的过程第18页/共21页第十九页，共21页。 DNA DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNADNA分子在高于等电点的分子在高于等电点的pHpH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定(ydng)(ydng)的电场强度下，的电场强度下，DNADNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNADNA分子本身的大小和构型。当分子本身的大小和构型。当DNADNA分子大小超过分子大小超过20kb20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开，此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开，此时电泳的迁移率