肿瘤淋巴管生成与肿瘤淋巴转移的研究进展

1、山东大学大学生科技创新基金项目（编号:137)肿瘤淋巴管生成与肿瘤淋巴转移的研究进展完成人：叶鸿飞任为正山东大学医学院临床医学六年制04级1班肿瘤淋巴管生成与肿瘤淋巴转移的研究进展叶鸿飞任为正综述指导老师毕玉顺教授（叶鸿飞、任为正，山东大学医学院临床六年制04级1班，山东济南250012）摘要肿瘤淋巴管的生成在肿瘤转移过程中起着至关重要的作用，本文就淋巴管生成的研究进展、淋巴管内皮生长因子及其作用机制、肿瘤淋巴道转移以及抗肿瘤新生淋巴管的治疗前景予以综述。关键词淋巴管生成；VEGF-C;VEGF-D;肿瘤转移侵袭和转移是恶性肿瘤的基本特征，也是影响疗效和导致患者死亡的主要原因。肿瘤发生播散和转

2、移的途径主要有：（1）局部浸润；（2）体腔、体表直接种植；（3）经血管的血性转移；（4）经淋巴管的淋巴转移。其中淋巴转移发生在大多数肿瘤转移的初始阶段，是确定临床治疗方案和预测肿瘤患者预后的重要依据。而淋巴转移是恶性肿瘤的扩散的重要途径1,肿瘤内淋巴管的存在与否，或肿瘤内是否存在淋巴管的新生？由于长期以来缺乏特异性识别新生淋巴管的标志物，肿瘤淋巴管生成的研究未引起人们足够的重视，远远落后于肿瘤相关血管生成的研究。近年来随着淋巴分子生物学研究的深入，肿瘤淋巴管的研究也取得了令人鼓舞的进展。许多研究证实了VEGF-C及VEGF-D对肿瘤淋巴管生成的调控作用，使得肿瘤淋巴管生成的研究开始成为肿瘤淋巴

3、转移研究的热点。现就肿瘤淋巴管生成与肿瘤淋巴道转移的相关研究现状及进展综述如下。1 .淋巴管内皮标志物的研究进展1. VEGFR-3（淋巴管内皮特异性标记物）血管内皮生长因子受体-3,（ascularendothelialgrowthfactorreceptor3,VEGFR-3）又称flt-4,其基因编码产物在人类有两种剪接异构体，长异卞体c末端有额外65个氨基酸残基，在组织中检测到的主要类型为长异构体，参与淋巴内皮细胞活化后的信号传导。VEGFR-3是淋巴内皮细胞上第一个被克隆的分子标志。1996年Joukov等报道VEGFR-双表达于成人淋巴管内皮中，为淋巴管特异性的标记物。Witmer

4、等则通过连续切片法及PAL-E标记进一步证实了VEGFR-3m生脉管属于淋巴管3。研究显示，在胚胎早期，VEGFR-是胚胎血管形成的必要因素，在血管及淋巴管内皮细胞均有分布；到胚胎后期，其分布逐渐限于淋巴管，参与淋巴管的形成，在血管几乎不表达；在成人，VEGFR-走要见于淋巴管，而在阑尾、淋巴结、脾脏及骨髓也可检测到4。Bronislaw等的研究证明VEGFR-3特异性的表达于淋巴管内皮。而Anne等指出，鼻粘膜不同于其他组织，其血管与淋巴管均有VEGFR-3表达，发现在表达VEGF-C的鼻部及鼻咽部肿瘤瘤周检测到丰富的VEGFR-3阳性血管6,故而VEGFR-3能否作为一种特异性的肿瘤淋巴管

5、标记物尚待进一步研究证实。2. PodoplaninPodoplanin是一种肾小球足突细胞膜上的43kD黏蛋白7,表达于良性淋巴瘤和淋巴管内皮细胞，及人体肾足细胞、成骨细胞、肺泡I型上皮细胞和胸膜及胸腺上皮细胞，在皮肤淋巴管上也有强烈表达。王艳等8以podoplanin检测肺的恶性肿瘤和炎性假瘤淋巴管生成情况，发现其表达限于单一内皮细胞层的薄壁淋巴管，与CD31阳性血管数不相关。因此podoplanin被认为是在肿瘤转移研究中较特异的淋巴管标志物。3. Prox-1Prox-1是从果蝇prosper。基因克隆的同源基因，表达于晶状体、心脏、肝脏、胰腺和神经系统等的非内皮细胞，但在内皮细胞中仅

6、在成人正常组织、胚胎淋巴管内皮细胞或肿瘤组织的淋巴内皮细胞上可检测到9。移除prox-1基因后，胚胎发育时prox-1表达的原始静脉内皮细胞生成淋巴管过程被阻断，表明prox-1是淋巴管生成最基本的调控因子。缺乏Prox-1的婴儿常由于淋巴管芽生和分化缺陷而死亡10。4. LYVE-1LYVE-1是一种位于淋巴管腔面的特异性氨基葡聚糖透明质酸受体，与CD44糖蛋白同源，均匀分布在淋巴管的管腔面和基底面，可将透明质酸通过淋巴内皮转运至淋巴。Mouta等11的研究表明，LYVE-1也表达于肝血窦内皮细胞和胰、肾、肾上腺及甲状腺上皮细胞上，故而认为LYVE-1与prox-1联合检测会更好的标志淋巴管

7、内皮细胞12。其他标记物如5-核甘酸酶、桥粒蛋白(desmoplakin)、Lyp-1等，因尚缺乏严格的对比研究，是否可作为淋巴管内皮细胞特有标记物尚待考证。2 .肿瘤淋巴管生成1 .淋巴管内皮生长因子(1) VEGF-C:1996年Joukov等2从前列腺癌细胞中第一次纯化并克隆了Flt-4的配体VEGF-C,并且证实VEGF-C可诱导牛毛细血管内皮细胞在胶原上的迁移。作为最早发现的淋巴管生成因子，研究认为VEGF-C可通过旁分泌模式调节淋巴管的生长。Karkkainen13发现完全缺乏VEGF-C的鼠在出生前即死亡，而VEGF-C呈不同形式缺陷的鼠出生后常产生腹腔乳糜液集聚，提示VEGF-

8、C的单一功能不全即可影响淋巴管的发育。Simona14等采用胶原夹心实验发现VEGF-C可以选择性地诱导淋巴细胞存活且并促进淋巴内皮细胞增生、迁移，并形成管腔样结构。但应用淋巴管内皮细胞特异标记物LYVE-1进行免疫染色，发现VEGF-C不仅可促进瘤周及瘤内形成新的淋巴管，而且可促进原有淋巴管增生，管径增加，并诱导淋巴管间及淋巴管与血管间的吻合，从而促进淋巴转移及血性转移。Papoutsi15等对C6胶质瘤及10AS胰腺癌细胞的研究表明，后者高表达VEGF-C,且能诱导淋巴管向肿瘤内呈放射状生长，提示淋巴管生成因子VEGF-C对肿瘤淋巴管的生长是非常重要的。(2) VEGF-D:淋巴管生成因子

9、VEGF-D是VEGF家族中的新成员，于1998年被Achen16等通过计算机同源收搜发现并鉴定。VEGF-D是一种内皮细胞的有丝分裂原，其表达水平受c-fos的调节，Marconcini等将其称为Figf(c-fosinducodgrowthfactor),揭示了核癌基因与淋巴管形成之间的关系17。VEGF-D与VEGF-C高度同源，亦可诱导淋巴管生成。Stacked181等将VEGF-D基因转入肿瘤细胞，然后原位移植到SCID/NOD小鼠，结果发现转基因组瘤内淋巴管数目明显增多，形成大量的管状结构，多呈簇状，瘤周也有较多的淋巴管，而对照组仅在肿瘤包膜结缔组织有少量LYVE-1+染色的淋巴管

10、。转基因组局部淋巴结转移发生率为61%(14/23),明显高于对照组(0/14),表明VEGF-D也可诱导肿瘤淋巴管生成，促进肿瘤的淋巴转移。Makinen、Baldwin等的研究也表明，VEGF-D可诱导淋巴管生长，与淋巴管密度呈正相关19,20.。(3)作用机制：目前对于VEGF-。说进肿瘤淋巴管、血管生成及淋巴结转移的具体机制尚未阐明。有研究认为在肿瘤生长过程中由于缺氧或组织内压力增加等原因可导致VEGF-C或VEGF-防泌增多。而VEGF-C和VEGF-D通过与其受体VEGFR-3的作用促进淋巴管生成。Veikkola21等在VEGF-C156S(第156位半胱氨酸残基突变为丝氨酸，只

11、能激活VEGFR-3,而不能使VEGFR-2活化用VEGF-D转基因小鼠的研究中表明，VEGF-C156S和VEGF-D均可促进皮肤淋巴管增殖、管腔变大，证实通过VEGFR-3信号传导可诱导淋巴管生成。Bronislaw5等的研究证明，彻底阻断成熟小鼠的VEGFR-3可抑制正常组织及肿瘤中由VEGF-C诱导的淋巴管生成，而对血管生成、成活率和其他现有淋巴管功能无任何影响。因此认为VEGFR-3可调节淋巴管内皮细胞的增殖和移动，在淋巴管的再生中发挥重要的调节作用。该信号通路传导途径为，VR由VEGFR-3吉合后导致VEGFR-鳞酸化并激活SH侬白，使后者的SH2K与PTEK结合而发生自身磷酸化，

12、磷酸化的SHCf白可与调节蛋白Grb2的SH数结合，并促进Grb2的SH3K与尿喋吟核甘酸释放因子SoS吉合形成复合体，此复合体形成后激活Ras信号传导途径，并最终诱导细胞的有丝分裂途径。上述观点被Skobe等、Mandriota等许多学者所证实而得到认同【2223。2 .肿瘤淋巴管的分布及特点有的研究认为，肿瘤外周存在扩张、增多的淋巴管，肿瘤内部无淋巴管24。近年来发现，在多种肿瘤组织内部也存在微淋巴管、新生淋巴管及淋巴管样迷路，只是处于萎缩状态。廖新波发现人胃癌组织内有较多棕色条索状组织，有细小分支，管壁薄，结合HE染色认为是新生毛细淋巴管25;张彦斌26等的研究发现，直肠癌肿瘤周边区的淋

13、巴管密集分布，多呈圆形、多角形及扩张状，而肿瘤中心区的淋巴管相对稀疏且多表现为闭锁状或细条索样，提示直肠癌瘤周边区存在着淋巴管的生成，真正有功能的淋巴管多位于肿瘤周边区，而中心区的淋巴管可能大多处于无功能状态。有学者认为，肿瘤中心淋巴管密度（LVDit）显著低于肿瘤周边淋巴管密度（LVDpt）及肿瘤中心区淋巴管的无功能状态，可能是由于瘤内淋巴管在不断分化增殖的肿瘤细胞产生的机械压力和持续较高的瘤内组织压作用下发生塌陷、萎缩，或由于肿瘤细胞的入侵，破坏了淋巴管网络，使肿瘤内部仅留下残余的内皮细胞所致27。三.肿瘤淋巴转移淋巴管转移常常是一些肿瘤初始转移阶段最主要的途径，肿瘤细胞进入引流淋巴结，继

14、而再进入血流，造成更广泛的远处转移，威胁病人生命。许多研究认为，肿瘤细胞分泌的VEGF-C和VEGF-D诱导淋巴管生成，肿瘤淋巴管的增多将增加肿瘤细胞进入淋巴系统潜在进入点的密度，从而增加肿瘤细胞的转移潜能，这是肿瘤淋巴转移的一个可能机制。Shield28等研究（用免疫组化，LYVE-1为淋巴管特异抗体）表明，恶性黑色素瘤周围的淋巴管密度较正常区域淋巴管密度明显增加，分别为（102.5）/mm和（2.40.9）/mr2i并具有统计学意一、一一一一2义。而且黑色素瘤伴转移者的淋巴管密度明显高于无转移者，分别为（12.81.6）/mm和（5.41.1）/mm但Nisato29提出，VEGF-C不是

15、通过促进淋巴管增生，而是通过活化已存在的淋巴管来完成肿瘤淋巴道转移。在临床研究中，应用RT-PCR、原位杂交、免疫组化均显示在原发性肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、睾丸癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、胸膜癌、头颈部鳞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤等中淋巴结转移、淋巴管浸润与VEGF-C或VEGF-D之间的明显相关30,31,32。但并非癌症中一定出现VEGF-C和VEGF-D的过度表达。Krishnan33等研究发现，虽然VEGF-C和VEGF-D在肿瘤细胞和肿瘤间质细胞中均表达，但在培养的肿瘤细胞中并不表达，提示肿瘤微环境的分子组成可能对这些因子的表达具有举足轻重的作用。有

16、研究认为VEGF-C表达与肿瘤深度、淋巴管及静脉浸润、淋巴结及肝转移相关。VEGF-D表达与肿瘤深度、淋巴结转移及肝转移相关34。1 .VEGF-C作用VEGF-C的表达在肿瘤转移方面具有重要作用。Skobe23等首先将绿色荧光蛋白（GFP）转入人MDA-MB-435乳腺癌细胞以便于观察肿瘤微转移，再将VEGF-CcDN舟入MDA-MB-435GF钿胞，获得稳定表达VEGF-CGFP勺细胞株，然后原位移植到裸小鼠双侧乳腺颊脂垫，12周后处死小鼠进行检测。观察结果显示，表达VEGF-Ca瘤周淋巴管明显扩张，且有很多淋巴管侵入瘤体内，甚至深达肿瘤中心，管腔多不连续，腔内多含有肿瘤细胞，淋巴内皮细胞

17、增生活跃，腋窝淋巴结内可观察到转移的肿瘤细胞，肺部转移灶明显增多、增大。表明VEGF-CT促进乳腺癌淋巴管生成，增加局部淋巴结转移和远处（肺）转移的发生。Mandriota等用鼠模型研究了VEGF-C勺作用，发现该基因与VEGFR-3吉合可诱导淋巴管生成，促进肿瘤细胞播散及淋巴结转移22。Salyen35等提出50%的人类肿瘤可检测到VEGF-C勺表达，且主要表达于肿瘤细胞的细胞质；而Furudoi等的研究提示VEGF-陈不同细胞中的表达并不相同，并发现它优先在受肿瘤浸润的最深部位表达36。在人类许多恶性肿瘤原发组织中VEGF-C勺表达与区域淋巴结转移显著相关。一些最近的研究也证实，VEGF-

18、CVEGFR-3勺表达有利于结肠癌细胞淋巴道侵袭、转移的发生37。VEGF-蕃与非小细胞肺癌淋巴管生成，从而促进淋巴结转移38。而Veikkola21等检查宫颈癌的标本证明，用RT-PC检测的VEGF-CmRNA水平是影响骨盆淋巴结转移的独立因素。Tang39等发现80%的胰腺癌组织表达VEGF-CVEGF-必表达与淋巴管浸润、淋巴结转移密切相关。HoarFJ40等通过对51例乳腺癌肿瘤标本进行免疫组织化学分析，30例（59%）VEGF-VEGF-Cf淋巴结转移情况、淋巴、血管侵犯、骨髓微转移（应用免疫磁化分析及免疫细胞化学分析）、肿瘤大小、分级及ER青况无明显相关性。VEGF-C的表达和Ce

19、rbB-2有关。这种VEGF-C和CerbB-2之间的关系可能反映了两者之间功能性的联系，部分解释了CerbB-2阳性的肿瘤具有侵袭性的原因。Kishimoto41等在口腔鳞癌的研究中发现，正常上皮组织无VEGF-C勺表达，53.2%的癌组织VEGF-臻达阳性，其中有淋巴结转移占73.3%，无淋巴结转移占34.4%，而且VEGF-C的阳性表达与患者的预后有关。Furudoi在晚期直肠癌的研究中发现，VEGF-（的表达与直肠癌的淋巴管浸润、淋巴结转移，Dukes分期、肝转移等有关，多因素分析显示VEGF-（的表达和淋巴结转移是独立的预后因素36。Kawakam等研究结果也有相似的发现42。但也有

20、否认其相关性的报导：Arinaga等43的研究未发现VEGF-必表达与淋巴结转移的相关性，却发现VEGF-日性表达组的5年生存率（47%）明显低于阴性表达者（7O%）,同样，VEGFR加性表达组的5年生存率（28%）明显低于阴性表达组（59%）;而VEGF-体口VEGFR-的为阳性表达的预后最差。关于乳腺癌的研究也认为VEGF-荣达与淋巴结转移没有相关性，但它是一个预测无病生存的不良指标44。但Kitadai等对71例ESC德者进行单变量和多变量分析表明，VEGF-C表达和患者预后无相关关系（P=0.80）45。Hd46等发现高表达VEGF-酰人月制N1W田胞（侵袭性差）可诱导瘤内和瘤周淋巴管

21、生成，但并不增加局部淋巴结转移，表明肿瘤细胞恶性表型的转变是一个复杂的过程，可能涉及多种基因的参与，这可能是由于不同癌症自身特异性所致。2 .VEGF-D作用White47等将VEGF-隙色分为高、低染色两组经多变量分析，结果发现结肠癌VEGF-DVEGFR-赛达也与淋巴结转移、组织类型和浸润深度相关。VEGF-嘀表达与MVDDukes分期（A到C）或肿瘤分化无关，但与淋巴管浸润和患者生存有关，VEGFR-3日性管道密度与MVD有关，但与Dukes分期（A到C）、肿瘤分化以及VEGF-DE达无关。又105例早期胃癌的研究发现，VEGF-D勺表达随肿瘤浸润深度的增加而增强48.Nakamura4

22、9等研究发现乳癌中VEGF-D的表达与淋巴结的转移相关，其10年无病生存率显著下降，且伴有c-erbB-2的过表达。基因转染表达VEGF-D的人肾细胞癌异种移植瘤中也观察到VEGF-D诱导淋巴管形成，并且经淋巴管至局部淋巴结转移发生率显著增加。VEGF-D在恶性黑色素瘤、黑色素瘤细胞株和炎性乳腺癌中表达亦升高。Stacked181等通过对淋巴管内皮细胞的特异性标志物LYVE-1的染色发现，VEGF-D不但可诱导肿瘤内的淋巴管生成，而且可导致肿瘤细胞向附近淋巴道播散，其诱导的淋巴道播散可被VEGF-D的特异性单克隆抗体所阻断。Orlandini等50的研究明，3-链接素又VEGF-DmRNA起负

23、向调节作用，故而VEGF-D可能仅在3链接素缺失或低表达的肿瘤中对淋巴结转移起到一定作用。不同学者报道，肿瘤内VEGF-D的表达水平存在明显差异。Kitadai等51研究显示VEGF-DmRNA在肿瘤组织中的表达低于正常胃黏膜。George等52证实，RT-PCR方法测得的直肠癌肿瘤中VEGF-DmRNA水平低于正常组织，而免疫组化染色结果显示，肿瘤中VEGF-D蛋白表达呈较高水平，VEGF-D蛋白表达水平与淋巴转移及低生存率相关。George设，VEGF-D水平在由腺瘤向癌发展过程中的降低使更多的血管形成因子VEGF-A和VEGF-C更容易地与其受体结合，以启动肿瘤生长所需要的新生血管的增生

24、。四、抗肿瘤新生淋巴管治疗展望大量研究表明VEGF-C/VEGF-D可通过活化VEGFR-3,促进淋巴管生成，从而增加肿瘤淋巴道转移的发生率。因此针对VEGFR-3信号转导系统的抗淋巴管生成治疗，有望成为抗淋巴转移的一个有效途径。而其中每一个环节都可能成为控制肿瘤生长、转移以及治疗肿瘤的理想靶点，抑制该信号通路传导，达到抗肿瘤淋巴转移的目的。如可以VEGF-C、VEGF-D蛋白水解过程为靶点，抑制其活化53;应用VEGF-D的中和抗体，抑制其过表达的肿瘤细胞的淋巴结转移54,55;用可溶性VEGFR-3-Ig封闭VEGF-C活性56;利用雌激素拮抗剂阻滞VEGF-D生成57;利用siRNA转基

25、因隐性载体抑制VEGF-C的表达58等等。但最近也有研究表明，自发RIP-Tag2肿瘤在撤离VEGF抑制剂一周后血供即完全恢复，而再次使用时效果与初次相同。针对VEGF-C/D的抑制剂是否有类似的现象尚无具体报道，有待进一步研究59。此外，生长抑素可能通过对VEGF-C/FLT-4信号通路的阻滞而抑制大肠癌淋巴管生成及转移60。总之，虽然在肿瘤淋巴管生成与肿瘤淋巴转移中还有许多问题尚未明确，但随着研究的不断深入，抗肿瘤新生淋巴管治疗有望成为肿瘤生物治疗的新模式，具有良好的临床应用前景。参考文献1 .MichaelS.Pepper,LymphangiogenesisandTumorMetasta

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