激光共聚焦显微镜的优势学习教案

1、会计学1激光共聚焦激光共聚焦(jjio)显微镜的优势显微镜的优势第一页，共45页。荧光荧光(ynggung)(ynggung)显微镜显微镜Fluorescence microscopy 荧光显微镜是用来观察研究样品荧光现象的光学显微镜，目前主要由光源、滤片系统、光路系统等组成。 广泛应用在生命科学领域，可对组织和细胞的结构、形态、蛋白质表达、亚细胞结构等进行定位(dngwi)、定性观察及分析。第1页/共45页第二页，共45页。荧光荧光(ynggung)(ynggung)显微镜显微镜仪器型号：仪器型号： OLYMPUS IX73 研究级倒置研究级倒置(dozh)荧光显微镜荧光显微镜Fluores

2、cence microscopy参加过仪器使用培训，通过网上仪器知识考试，网上提前预约，管理员审核通过方可使用。参加过仪器使用培训，通过网上仪器知识考试，网上提前预约，管理员审核通过方可使用。注意事项：注意事项：汞灯使用时尽量减少启动次数；灯熄灭后要等待冷却才能重新启动；点燃灯泡汞灯使用时尽量减少启动次数；灯熄灭后要等待冷却才能重新启动；点燃灯泡(dngpo)(dngpo)后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min15min 放置地点放置地点 ：401-1312401-1312室室 管理员：吴安庆老师管理员：吴安庆

3、老师第2页/共45页第三页，共45页。第3页/共45页第四页，共45页。第4页/共45页第五页，共45页。 基本原理基本原理激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。（一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片）（一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片） 带通滤色镜带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（长、短通滤色镜组合（LP + KP）：）：LP450 + KP490 双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断阻断(z dun)滤镜：吸收和阻挡激发光进

4、入目镜；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。滤镜：吸收和阻挡激发光进入目镜；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。 多为长通滤色镜；多为长通滤色镜；LP490紫外蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光第5页/共45页第六页，共45页。第6页/共45页第七页，共45页。荧光显微镜的不足:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的同时采集及共定位。2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降(xijing)。3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。5.只能在二维环境下观察。6.样品不能

5、太厚。第7页/共45页第八页，共45页。激光激光(jgung)(jgung)共聚焦扫描显微镜共聚焦扫描显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ） 以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本轭聚焦技术，对样本(yngbn)进行断层扫描进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统第8页/共45页第九页，共45页。第9页/共45页第十页，共45页。激光共聚焦激光共聚焦(jjio)(jjio)扫描显微镜扫描显微镜OLYMPUS FV1200 研究级倒置研究级

6、倒置(dozh)荧光显微镜荧光显微镜 参加过仪器使用培训，通过网上仪器知识考试，网上提前预约，管理员审核通过方可使用。注意事项：1、开机和关机需要管理员来操作2、换样本的时候需要将物镜降下来，或点击(din j)软件上Escape3、能用普通荧光显微镜观察拍照的样本就不要用共聚焦显微镜，节约激光器寿命。放置地点：放置地点：401-1312室室管理员：吴安庆老师管理员：吴安庆老师收费：收费：200元元/小时小时 第10页/共45页第十一页，共45页。上转换共聚焦上转换共聚焦(jjio)(jjio)扫描显微镜扫描显微镜多线氩离子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm)半导体激光器：4

7、05 nm, 559 nm, 635 nm上转换专用激光器：808 nm,980 nm活细胞(xbo)CO2培养系统OLYMPUS FV1200放置放置(fngzh)地点：地点：401-1111管理员：吴艳管理员：吴艳普通激光共聚焦显微镜的功能上转换材料的成像检测普通共聚焦：400元/小时上转换共聚焦：1000元/小时院内5折，校内8 折只允许3天后15天内的预约第11页/共45页第十二页，共45页。仪器仪器(yq)(yq)参数参数针孔光栏分光镜发射(fsh)荧光单色器及检测器多线氩离子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm)半导体激光器：405 nm, 559 nm, 635

8、nm上转换(zhunhun)专用激光器：808 nm,980 nm计算机图像存储与处理及控制系统IX83第12页/共45页第十三页，共45页。仪器仪器(yq)(yq)参数参数第13页/共45页第十四页，共45页。仪器仪器(yq)(yq)参数参数第14页/共45页第十五页，共45页。仪器仪器(yq)(yq)参数参数第15页/共45页第十六页，共45页。基本原理基本原理第16页/共45页第十七页，共45页。 1、光源 用激光(jgung)做光源，从理论上消除了色差。因为激光(jgung)的单色性强、光源波束集中、波长相同。2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光

9、挡住，消除了球差。第17页/共45页第十八页，共45页。激光器扩光器样品(yngpn)滤光片针孔(zhn kn)检测器入射光发射(fsh)光长通滤光片仪器特点第18页/共45页第十九页，共45页。入射光发射(fsh)光长通滤光片激光器扩光器样品(yngpn)滤光片针孔(zhn kn)检测器仪器特点第19页/共45页第二十页，共45页。入射光发射(fsh)光长通滤光片激光器扩光器样品(yngpn)滤光片针孔(zhn kn)检测器仪器特点第20页/共45页第二十一页，共45页。仪器(yq)特点第21页/共45页第二十二页，共45页。激光共聚焦激光共聚焦(jjio)(jjio)显微镜显微镜的优势的优

10、势第22页/共45页第二十三页，共45页。 石蜡切片，冰冻切片，涂片，印片、铺片，培养的粘附细胞，悬浮细胞，各种( zhn)染色，非染色荧光标记的组织（包括活组织） 激光共聚焦激光共聚焦(jjio)(jjio)显微镜显微镜的样本的样本第23页/共45页第二十四页，共45页。第24页/共45页第二十五页，共45页。第25页/共45页第二十六页，共45页。鼠成纤维细胞单克隆anti-tubulin标记(bioj) 第26页/共45页第二十七页，共45页。涡虫(w chn)纲扁虫肌动蛋白丝鬼笔环肽第27页/共45页第二十八页，共45页。培养的人肝癌细胞(xbo)吖叮橙染色第28页/共45页第二十九页

11、，共45页。 荧光信号(xnho)通过光电倍增管转化为电信号(xnho)，经过电脑分析可对荧光信号(xnho)进行相对定量测定。随机圈取细胞随机圈取细胞(xbo)可得到所圈细胞可得到所圈细胞(xbo)的相对荧光强度值的相对荧光强度值第29页/共45页第三十页，共45页。第30页/共45页第三十一页，共45页。第31页/共45页第三十二页，共45页。 较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测(gunc)损伤。标记细胞为损伤细胞。第32页/共45页第三十三页，共45页。第33页/共45页第三十四页，共45页。绿色：SYBR 14染色(rns)，活精子红色：PI染色(rns)，死精子肺动脉内皮

12、细胞蓝色：Hoechst 33342 ，染DNA红色：PI，染核仁RNA绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白第34页/共45页第三十五页，共45页。高速双转盘活高速双转盘活(pn hu)(pn hu)细胞共聚焦成像系统细胞共聚焦成像系统 型号：型号：UltraView VoX（PerkinElmer）放置地点放置地点(ddin)：401-1310管理员：封琼管理员：封琼收费：收费：200元元/小时小时 物镜(wjng)： 10X，20X，40X，60X (oil) ，100X (oil)激光器： 405nm， 440nm， 488nm， 514nm， 561nm， 640nm载物台式

13、活细胞培养装置：恒温、恒湿、5%CO2活细胞长时间观察：硬件防漂系统图像分析平台：三维立体观测，三维定量分析第35页/共45页第三十六页，共45页。高速双转盘活细胞高速双转盘活细胞(xbo)(xbo)共聚焦成像系统共聚焦成像系统 第36页/共45页第三十七页，共45页。速度更快速度更快灵敏度更高灵敏度更高光毒性更低光毒性更低实现活细胞实现活细胞(xbo)3D6D（XYZTWP）实时成像）实时成像高速双转盘活高速双转盘活(pn hu)(pn hu)细胞共聚焦成像系统细胞共聚焦成像系统 第37页/共45页第三十八页，共45页。l 可实现多种荧光染料标记的活细胞(xbo)和固定细胞(xbo)/组织的共聚焦成像。l 能够对活细胞(xbo)或活体组织实施低光漂白、低光毒性的连续扫描，有助于长时间维持细胞(xbo)的活性,适于观察细胞(xbo)周期、细胞(xbo)骨架动态等长时间或极度光敏感过程。l 能够在高分辨率和高灵敏度的情形下，观察快速的生物过程，如蛋白质的细胞(xbo)膜输运和钙释放/钙闪过程。l 能够完成三维、多荧光通道、多位点、长时程平行检测，适于复杂实验的多维图像采集【空间三维（xyz）、时间（t）、波长（w）、位置（p）】。高速双转盘活细胞高速双转盘活细胞(xbo)(xbo)共聚焦成像系统共聚焦成像系统 第38页/共45页第三十九页，共45页。第39页/共45页