单克隆抗体药物的临床前研发

1、单克隆抗体药物的临床前研发背景知识 大分子药物生物制药始于1982年用重组DNA技术进行生物合成的人胰岛素(rHI)举例举例激素 (胰岛素，胰高血糖素，生长激素)造血生长因子(Erythropoietin, colony stimulating factors)干扰素 (Interferons-, -, -)白介素 (Interleukin-2)疫苗 (Hepatitis B surface antigen)肿瘤坏死因子 治疗用酶单克隆抗体来源于细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等各种表达体系研发流程靶点的发现与选择单克隆抗体的制备药效筛选药动评价临床试验靶点的发现和选择集中在细胞死亡通路、

2、血管生成、细胞周期调控信号转导细胞死亡通路、血管生成、细胞周期调控信号转导等方面例如： CD20 :表达于B细胞和成熟B细胞，调节B细胞增殖、分化；在95%以上的B细胞性淋巴瘤中表达 抗抗CD20单抗单抗可用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤 单抗药物工作机理： 抗体依赖性细胞介导的毒作用( antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 补体依赖性细胞毒作用( complement dependent cytotoxicity, CDC) 中和细胞因子 单抗药物作用机理经典靶点靶点靶点表达细胞表达细胞抗体药抗体药商品名商品名厂家厂家CD20D

3、audi,raji,RPMI-8226利妥昔单抗（Rituximab）美罗华（Rituxan） 罗氏Her2MDA-MB-231,MCF-7,SK-OV-3曲妥珠单抗（Trasduzumab）赫赛汀（Herceptin）罗氏EGFRA431,A549西妥昔单抗（Cetuximab）爱必妥（Erbitux）默克雪兰诺TNFCHO-DG44-tnf阿达木单抗（Adalimumab）修美乐（Humira）雅培VEGFHUVEC贝伐珠单抗（Bevacizumab）阿瓦斯汀（Avastin）罗氏 单克隆抗体的制备 抗体的人源化 嵌合抗体：应用DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重

4、组, 再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达 CDR 移植抗体（改型抗体）：进一步用人的编码构架区( FR) 替代鼠FR, 形成更为完全的人源化抗体, 即除了3 个CDR 是鼠源的外, 其余全部是人源结构 完全人源化抗体：1、噬菌体抗体库技术；2、转基因小鼠技术药效筛选特异性与亲和力鉴定：特异性与亲和力鉴定：ELISA, WB, FACS, IHC, IP 等等功能鉴定：功能鉴定： ADCC, CDC, 中和细胞因子中和细胞因子by抗体生产部门by药效部门 ADCCLDH releaseADCC Assay on SK-BR-3 Cells with NK92-CD16AAb Concentra

5、tion, g/ml% Target Cell Lysis10-410-2100102-10010203040506070Herceptin(control)#Herceptin (control)log(agonist) vs. response - Variable slope (four parameters)Best-fit valuesBottom0.6537Top31.88LogEC50-2.545HillSlope1.118EC50,g/ml0.002854药效筛选CDC-CTGRituxanlog(agonist) vs. response - Variable slope (

6、four parameters)Best-fit valuesBottom6.625Top100.1LogEC50-0.5091HillSlope3.069EC50, g/ml0.3096药效筛选cell proliferation and antibody neutralizationVEGFBest-fit valuesBottom117.7Top526.2LogEC500.6934HillSlope1.875EC50,ng/ml4.936Span408.6AvastinBottom25.7Top101.1LogEC50-1.386HillSlope-1.8EC50,ng/ml0.0410

7、7Span75.4药效筛选评估ADA是否会影响药效药动评价Pharmacokinetics, PKAnti-drug antibodies, ADANeutralizing Anti-drug antibody, NAbcell-basednon-cell-based主要评估血清中药物水平，不被肾脏清除，半衰期长；单抗的主要代谢结果是降解为肽段和氨基酸，无需进行生物转化研究评估免疫原性，是否产生ADA包被抗原 优化包被液种类 优化抗原浓度4孵育过夜 N.A.封闭 优化封闭液种类及浓度孵育一抗 优化一抗梯度稀释的跨度、倍数 优化孵育时间、温度孵育二抗 优化二抗工作浓度 优化孵育时间、温度显色及终止 加TMB后避光孵育显色，10-30 min后适时终止 间接法ELISA建立流程优化案例优化案例使用标准品建立实验时，假设二抗工作浓度已经确定，不同抗原浓度与一抗浓度正交实验MSD旗下明星药物，旨在利用人体