医学免疫学实验Djp1 免疫学实验课_1_沉淀反应

1、1免疫学诊断、沉淀反应2 实验室安全门窗、水、电、火源w实验结束后关闭门窗、水、电、火源w酒精灯和易燃物的使用注意事项；棉塞着火须报告老师w电源空气开关w水的使用实验室安全生物安全w白大褂的穿着要求w不得将实验无关物品带入实验室w不得在实验室内饮食w不得擅自开UV灯w污染及潜在污染物品须进行消毒处理3 实验课要求w遵守上述规则w必备物品：实验指导、实验报告、红蓝铅笔、白大褂w注意保护自己、爱惜实验室仪器和设施w按照实验要求，认真完成实验并如实记录实验报告w实验结束后整理本组的台面w实验废弃物分类（污染/潜在污染物、普通废弃物）放置；w在确认普通废弃物没有着火隐患后，倒入垃圾桶4 值日生的职责：

2、w检查实验台面的整理w整理实验室及垃圾w关闭所有非必需的电器和电源w逐一检查并确认水槽水龙头的关闭w关闭窗、门w最后离开实验室5单向免疫扩散 (讲解)双向免疫扩散试验（操作）3. 对流免疫电泳（看示教结果）6在半固体琼脂中进行： 单向免疫扩散双向免疫扩散对流免疫电泳 沉淀反应（原理）: 可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液、组织浸液、微生物蛋白等）与相应的可溶性抗体，在一定的抗原抗体比例下，在一定离子浓度的缓冲体系中，发生反应，出现沉淀物，称沉淀反应。在液体中进行： 免疫比浊法：浊度仪（分光光度仪/酶标仪）7 3. 可见性: -取决于抗原取决于抗原-抗体的抗体的浓度浓度和和比例比例； （1）足够

3、的浓度浓度： （2）适宜的比例比例： 最大最大的抗原抗原-抗体复合物抗体复合物的出现 （白色沉淀白色沉淀） 2. 可逆性：非共价键非共价键；温度、酸碱度、离子强度；（见后）（见后） 1. 特异性：抗原表位表位-抗体可变区可变区，特异性越强-亲和力亲和力越强抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点4.抗原抗体反应的二个阶段： i: 特异性结合阶段：快 ii: 可见反应阶段：数分钟-数日8(三) 影响抗原抗体反应的因素 1.温度： a: 分子热运动，温度越高，反应越快； b: 非共价键；蛋白质变性 c: 一般最适温度为一般最适温度为37 d: 4，过夜，过夜 2.电解质： a: 蛋白质， 两性分子 b

4、: 离子强度，盐析 c: 常用常用0.85%生理盐水生理盐水 3.pH： a: 一般最适一般最适pH6-8 b: 假阳性：等电点时，电荷为零, 沉淀/凝积9 定量分析 方法: （1）琼脂42-50溶化，加入已知已知浓度的抗体浓度的抗体，混匀，倒板，冷却，凝固，打孔 （2）孔中加待测抗原待测抗原， （3）37 ，扩散； 比例合适时，出现白色沉淀环比例合适时，出现白色沉淀环， （4）测定沉淀环沉淀环直径直径。 （5）根据标准曲线（方程），计数待测抗原的浓度待测抗原的浓度。已知浓度的抗体琼脂中含有制作标准曲线：已知的不同浓度的抗原y = k.x + b 赵x钱x孙x李x周x郑x* 制作标准曲线制作标

5、准曲线：5M10M20M40M80M 160Meg: 2M适宜的比例比例已知抗原的不同浓度5M10M20M40M直径直径2M10抗原和抗体分别分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由扩散; 相遇后，在比例合适处，形成沉淀线。*抗原或抗体的定性和组成分析。抗原抗体抗体抗原11根据沉淀线的形状，可鉴定两样本的抗原是相同、部分相同或完全不同如果Ag1和Ag2, 迁移率（浓度/分子大小）不同，如何？多克隆抗体（Ab-1,2,4）多克隆抗体（Ab-1,2,4）多克隆抗体（Ab-1,2,4）多克隆抗体（Ab-1,2,4）12 1、3孔加抗AFP抗体 2孔，AFP阳性对照血清 4孔，待检血清 pH 8.6巴比妥缓冲液1234+-抗体阳性对照待测血清13AbAg电场力pH8.6pI7.5pI4.8琼脂糖：在琼脂糖：在pH8.6的缓冲液中带负电的缓冲液中带负电与琼脂糖接触的可移动液体：带正电与琼脂糖接触的可移动液体：带正电电渗力合力合力移动方向移动方向原理：原理：14 对流免疫电泳对流免疫电泳151. 琼脂板制备 (1%，5ml) 2. 打孔；3. 加样；4. 湿盒扩散；37C，24h 123456Ab123456Ab Note1块玻片上打2套孔套孔，选较好的进行后续试验；注意检查加样样品是否正确，加样时勿溢出溢出