核酸提取与鉴定学习教案

1、会计学1核酸核酸(h sun)提取与鉴定提取与鉴定第一页，共55页。 核酸(h sun)的提取与鉴定第一节 预处理 第二节 DNA的提取(tq) 第三节 RNA的提取(tq) 第四节 核酸的鉴定 概述 第1页/共54页第二页，共55页。研究研究(ynji)对象：基因组对象：基因组DNA、质粒、质粒DNA、总、总RNA、mRNA过程过程(guchng)： 裂解：破碎裂解：破碎(p su)(p su)细胞，使细胞中的核酸细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中游离在裂解体系中 纯化：纯化：使核酸与其它杂质彻底分离，如使核酸与其它杂质彻底分离，如蛋白质、盐等蛋白质、盐等 总原则：总原则：应保证核酸一级结

2、构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。鉴定：鉴定：浓度、纯度、分子量、测序浓度、纯度、分子量、测序 （技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）（技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）第2页/共54页第三页，共55页。 （一）样品预处理（获取分散（一）样品预处理（获取分散(fnsn)细胞细胞） 捣碎(do su)或剪碎；加液氮研磨成粉状。第3页/共54页第四页，共55页。2、动物(dngw)样品新鲜样品，生理盐水洗，直接使用新鲜样品，生理盐水洗，直接使用(shyng)（或分装、或分装、-70/液氮低温保存）；液氮低温保存）；甲醛固定组织甲醛固定组织要先去掉甲

3、醛；石蜡包埋组织石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。第4页/共54页第五页，共55页。来源来源(liyun)：新鲜血液或者冻贮血液；：新鲜血液或者冻贮血液；抗凝剂：抗凝剂：一般用EDTA-Na2或柠檬酸钠（枸橼酸钠柠檬酸钠（枸橼酸钠 ），不可使用肝素；肝素；分离：分离：红白细胞，一般用明胶，加缓冲液悬浮白细胞。（血清（血清DNA是研究肿瘤的材料之一）是研究肿瘤的材料之一）第5页/共54页第六页，共55页。3、微生物培养物样品离心(lxn)获取菌体细胞，加缓冲液洗涤，加缓冲液悬浮菌体细胞。4、微生物混合样品用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。高速(o s)离心获取菌体细胞。用缓冲液洗

4、涤菌体细胞。加缓冲液悬浮菌体细胞。 第6页/共54页第七页，共55页。1 1、DNADNA提取用具的处理提取用具的处理 要求无菌；试剂、器材要求无菌；试剂、器材(qci)(qci)高高压干燥等进行无压干燥等进行无DNADNA酶处理。酶处理。2 2、RNARNA提取用具提取用具(yngj)(yngj)的处的处理理要求无菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温，提取条件要求严格。第7页/共54页第八页，共55页。裂解裂解(li ji)细胞，溶出细胞，溶出DNA除去除去(ch q)杂质杂质重新溶解重新溶解DNA沉淀、浓缩沉淀、浓缩DNA第8页/共54页第九页，共55页

5、。 破碎细胞，溶解破碎细胞，溶解(rngji)DNA(rngji)DNA：用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。微生物样品提取液：含表面活性剂微生物样品提取液：含表面活性剂SDSSDS、溶菌酶等、溶菌酶等动物样品提取液：含动物样品提取液：含SDSSDS、蛋白酶、蛋白酶K K等等植物样品提取液：含植物样品提取液：含CTABCTAB核酸酶可被核酸酶可被Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+等激活，提取液均含有螯合剂（如等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTAEDTA，柠，柠檬酸等），螯合这些离子。檬酸等），螯合这些离子。第9页/共54页第十页，共55页。

6、蛋白质蛋白质苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液第10页/共54页第十一页，共55页。3.沉淀DNA有机溶剂沉淀DNA：2倍体积无水乙醇（或1倍体积的异戊醇）再用75%乙醇清洗多次。4.重新(chngxn)溶解DNA将DNA溶于水或TE溶液。第11页/共54页第十二页，共55页。qCTABCTAB法原理（植物法原理（植物DNADNA提取提取(tq)(tq)经经典方法）典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。与核

7、酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖(du tn)、酚类等杂质后、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出(xch)，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。第12页/共54页第十三页，共55页。q SDS法原理法原理(yunl) SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能）条件下能裂解细胞裂解细胞(xbo)，使染

8、色体离析，蛋白变性，释放出核酸，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐提高盐(KAc或或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的水相中的DNA。第13页/共54页第十四页，共55页。DNA提取的一般提取的一般(ybn)流程流程第14页/共54页第十五页，共55页。质粒质粒DNADNA特点：特点：（1 1）细菌基因）细菌基因(jyn)(jyn)组组DNADNA以外的小型闭合环状双链以外的

9、小型闭合环状双链DNADNA分分子。子。（2 2）大都含有抗生素抗性基因）大都含有抗生素抗性基因(jyn)(jyn)。（3 3）可自我复制或表达。（重组）可自我复制或表达。（重组DNADNA技术中构建载体）技术中构建载体）（4 4）大小）大小1-300 kb1-300 kb。第15页/共54页第十六页，共55页。1 1、培养、培养(piyng)(piyng)细菌和扩增细菌和扩增质粒质粒n 加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌蛋白加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌蛋白质合成，抑制细胞分裂，但质粒会继续质合成，抑制细胞分裂，但质粒会继续(jx)复复制。制。 第16页/共54页第十七页，共55页。

10、2 2、收获、收获(shuhu)(shuhu)细菌和溶细菌和溶菌菌 离心收集细菌细胞。离心收集细菌细胞。 细菌裂解细菌裂解(li ji)(li ji)方法：方法： 机械法机械法 化学试剂法化学试剂法 （SDSSDS） 溶菌酶化学试剂联合法（最常用）溶菌酶化学试剂联合法（最常用）第17页/共54页第十八页，共55页。3 3、分离、分离(fnl)(fnl)质粒质粒DNADNA基因组基因组DNADNA与质粒与质粒DNADNA分离分离(fnl)(fnl)碱裂解法（最常用碱裂解法（最常用(chn (chn yn)yn)） 用溶液用溶液1 1（EDTAEDTA）悬浮菌体。）悬浮菌体。 溶液溶液2 2（Na

11、OHNaOH和和SDSSDS）裂解菌体，蛋白质与）裂解菌体，蛋白质与DNADNA发生变性。发生变性。 溶液溶液3 3中和中和pHpH，质粒，质粒DNADNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，基分子能够迅速复性，呈溶解状态，基因组因组DNADNA不复性与蛋白质形成絮状沉淀。不复性与蛋白质形成絮状沉淀。 离心后，质粒离心后，质粒DNADNA留在上清液中。留在上清液中。第18页/共54页第十九页，共55页。 通过加热，使细菌裂解、蛋白质和通过加热，使细菌裂解、蛋白质和DNADNA变性。变性。 降低温度，质粒降低温度，质粒DNADNA复性留于上清液，基因组复性留于上清液，基因组DNADNA复性很慢与蛋复性

12、很慢与蛋白质形成沉淀白质形成沉淀(chndin)(chndin)，可通过离心除去。，可通过离心除去。煮沸裂解法（偶尔煮沸裂解法（偶尔(u r)(u r)用）用）梯度梯度(t d)(t d)离心法（极离心法（极少用）少用） 基因组基因组DNADNA断裂，吸附大量断裂，吸附大量EBEB，密度大；质粒，密度大；质粒DNADNA密度小。密度小。 利用氯化铯梯度离心，分离基因组利用氯化铯梯度离心，分离基因组DNADNA和质粒和质粒DNADNA。第19页/共54页第二十页，共55页。4 4、质粒、质粒DNADNA的纯化的纯化(chn hu)(chn hu)蛋白质蛋白质苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液第20

13、页/共54页第二十一页，共55页。所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎(p su)；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 最关键的是抑制RNA酶的活性。第21页/共54页第二十二页，共55页。第22页/共54页第二十三页，共55页。第23页/共54页第二十四页，共55页。第24页/共54页第二十五页，共55页。第25页/共54页第二十六页，共55页。第26页/共54页第二十七页，共55页。第27页/共54页第二十八页，共55页。3 3、氯化锂、氯化锂- -尿素

14、尿素(nio s)(nio s)法法 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶； 氯化锂选择性沉淀RNA。 其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会丢失一些小分子RNA。第28页/共54页第二十九页，共55页。第29页/共54页第三十页，共55页。5 5、试剂盒快速、试剂盒快速(kui s)(kui s)提取法提取法第30页/共54页第三十一页，共55页。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞(xbo)，使细胞(xbo)中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活

15、性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。第31页/共54页第三十二页，共55页。1）实验前取冰，）实验前取冰，4离心机预冷，离心机预冷，DEPC处理水（高压处理水（高压(goy)灭菌处理）配制的灭菌处理）配制的75%乙醇乙醇4预冷；预冷；2）1ml Trizol匀浆匀浆(yn jin)好的样品；好的样品；3）加入）加入0.2ml氯仿氯仿，颠倒颠倒混匀（混匀（15秒秒）“慢慢”，氯仿使蛋白变性，氯仿使蛋白变性4）室温室温，静置，静置3分钟分钟；5）离心机）离心机4、14000转转/分，离心分，离心15分钟分钟；静置；静置1分钟分钟（分层（分层即可；样品

16、会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，即可；样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要存在于水相中）主要存在于水相中）6）取上清取上清0. 5ml（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也不要吸到中间层的物质）不要吸到中间层的物质）放入另一个放入另一个1.5ml的的EP管中；管中；7）加入等体积的）加入等体积的异丙醇异丙醇（0.5ml），涡旋混匀；），涡旋混匀；第32页/共54页第三十三页，共55页。8）室温，静置）室温，静置10分钟（该条件由分钟（该条件由Trizol试剂盒提供；其他试剂盒提供；其他(qt)提供的条件

17、用提供的条件用-20、1小时，目的为了更好分层）小时，目的为了更好分层）9）离心）离心(lxn)机机4、14000转转/分，离心分，离心(lxn)10分钟分钟10）弃上液）弃上液(移液器调至移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步步，沿液面吸弃约，沿液面吸弃约0.9ml上清；第上清；第2步，沿液面吸弃其余步，沿液面吸弃其余(qy)上清上清;注注意吸头不要接触到沉淀斑区）意吸头不要接触到沉淀斑区）11)沿试管内壁轻轻加入沿试管内壁轻轻加入1ml 4预冷的预冷的75%乙醇乙醇,注意切勿冲击注意切勿冲击到沉淀斑区到沉淀斑区12）离心机）离心机4、10000转转/分

18、，离心分，离心5分钟分钟13）弃上液弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过程中把程中把RNA烤干），烤干），60恒温箱干燥恒温箱干燥5分钟分钟（注意：打开管盖；或用真（注意：打开管盖；或用真空干燥空干燥5分钟）分钟）14）加入）加入50l DEPC处理水处理水溶解溶解（可以根据管底的白色沉淀判断（可以根据管底的白色沉淀判断RNA量的多少加量的多少加DEPC处理水）处理水）15）-80冰箱保存。冰箱保存。第33页/共54页第三十四页，共55页。第34页/共54页第三十五页，共55页。第35页/共54页第三十六页，共55页。OD260

19、1时（比色皿厚度时（比色皿厚度(hud)1.0cm）双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml，单链单链DNA或或RNA浓度为浓度为40 g/ml。DNA(g/ml) = OD26050RNA（g/ml ） = OD26040第36页/共54页第三十七页，共55页。DNA样品：样品：OD260 / OD280 1.8 ，DNA纯度高纯度高OD260 / OD280 1.8，含，含RNA，或，或DNA部分降部分降解解(jin ji)OD260 / OD280 1.8，含苯酚或蛋，含苯酚或蛋白杂质白杂质RNA样品：样品： OD260 / OD280 1.82.0 RNA纯度高纯度高 2.0，RNA出

20、现降出现降解解(jin ji)第37页/共54页第三十八页，共55页。 凝胶上RNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条带，其中(qzhng)28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍，5s rRNA 较弱。 电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。第38页/共54页第三十九页，共55页。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：多用于鉴定较大核酸多用于鉴定较大核酸(h sun)片段（片段（0.160 kb）聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于鉴定较小的核酸用于鉴定较小的核酸(h sun)片段（片段（501000 bp）六、电泳六、电泳(din yn)第