SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方

1、SDS-PAGE1、 SDS-PAGE ：聚丙烯酰胺凝胶电泳2、 Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr（质量比Acr： Bis=29:1 ）3、 Bis：甲叉双丙烯酰胺4、 DDW ：超轻水5、 SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠，阴离子去污剂（配胶时用10%）6、 APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%7、 TEMED ：四甲基乙二胺，促凝剂8、 Tris-Hcl ： 3 羟基氨基甲烷盐酸缓冲液，配胶时（分离胶ph=8.8，浓缩胶ph=6.8）9、 DTT：二硫苏糖醇，DTT 也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。10、 IM

2、A： 碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有机合成，在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂，用于多肽测序以及酶抑制剂等，蛋白组学级试剂。CH>2ICONH>2 ，是和碘乙酸一样，可通过下列反应不可逆地抑制SH 酶类的物质。1） 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，分离胶（即下层胶）：SDS-PAGE 分离胶浓度最佳分离范围6% 胶50-150kD8% 胶30-90kD10% 胶20-80kD12% 胶12-60kD15% 胶10-40kD再按照下面的表格配制SDS-PAGE 的成分配制不同体积SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（毫升）6% 胶51015203050蒸馏水2.04

3、.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同体积SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（毫升）8% 胶51015203050蒸馏水1.73.35.06.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31M Tris,pH8.81.93.85.77.

4、611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（毫升）10%胶51015203050蒸馏水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0

5、040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（毫升）12%胶51015203050蒸馏水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同体积SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（毫升）15%胶51015203050蒸馏水0.51

6、.01.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS 即可配制成非变性PAGE 胶。1） 按照如下表格配制SDS-PAGE 的 浓缩胶（也称堆积胶、积层胶或上层胶）：成分配制不同体积SDS-PAGE 浓缩胶所需各成分的体积（毫升）5% 胶2346810蒸馏水

7、1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71M Tris,pH8.80.250.380.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%过硫酸铵0.020.030.040.060.080.1TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01TBST 缓冲液每 2L 体积中含：1M TrisHCL(pH7.5)100mLNacl16gKCL0.4g吐温1ml1） 抗体去除液每 50mL 抗体去除液中含：0.5M TrisHCL ( pH6.8)6.25mL10%SDS10m

8、LBeta-ME0.175mL水33.75mLSDS-PAGE电泳的基本原理：SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g 去污剂结合。当分子量在15KD 到200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX ，式中： MW 为分子量，X 为迁移率，k、 b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8 ，分离胶选择pH8.8 ，选择 tris HCL 系统，具体作用后面介绍；