1分子生物学改造学习教案

1、会计学11分子生物学改造分子生物学改造n蛋白质工程的主要技术之一是蛋白质工程的主要技术之一是定定点突变技术点突变技术.第1页/共102页第2页/共102页第3页/共102页第4页/共102页第5页/共102页第6页/共102页第7页/共102页第8页/共102页第9页/共102页第10页/共102页第11页/共102页第12页/共102页第13页/共102页第14页/共102页突变葡萄球菌核酸酶与含突变葡萄球菌核酸酶与含-SH寡核苷酸结合示意图寡核苷酸结合示意图第15页/共102页第16页/共102页 第17页/共102页四、定点突变的常用方法第18页/共102页第19页/共102页第20页/

2、共102页第21页/共102页 将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入M13 DNA载体上，导入具有载体上，导入具有dUTP酶酶（dut）和）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷的大肠杆菌（）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株）菌株中。中。 Dut缺陷缺陷导致细胞内导致细胞内dUTP水平上水平上升升，并在，并在DNA复制时，部分取代复制时，部分取代dTTP进入进入DNA新生链中。又由于新生链中。又由于ung缺陷缺陷使掺入使掺入DNA的的dUTP残残基不能除去基不能除去。由这种大肠杆菌菌株。由这种大肠杆菌菌株产生的产生的M13单链单链DNA大约有大约有1%的的T被被U所

3、取代所取代，然后进行，然后进行DNA定点定点突变。突变。双链双链DNA导入正常的大肠杆菌中导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶，其尿嘧啶N-糖基化酶除去糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。链上的尿嘧啶碱基。结果原来的结果原来的M13模板链被降解，模板链被降解，只有突变链因不含只有突变链因不含U，被保留，被保留下来。这种方法产生的下来。这种方法产生的M13噬菌噬菌体中含有突变体中含有突变DNA的比例大大增的比例大大增加。加。第22页/共102页第23页/共102页 PCR进行寡核苷酸进行寡核苷酸定点突变的示意图定点突变的示意图 第24页/共102页效率效率第25页/共102页第26页/共102页第27

4、页/共102页（圆点指突变位点）（圆点指突变位点）第28页/共102页第29页/共102页第30页/共102页第31页/共102页第32页/共102页第33页/共102页第34页/共102页通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性第35页/共102页通过引入通过引入二硫键二硫键提高蛋白的稳定性提高蛋白的稳定性 蛋白质分子中两个半胱氨酸的巯基之间氧化脱氢即形成二蛋白质分子中两个半胱氨酸的巯基之间氧化脱氢即形成二硫键。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子硫键。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可以提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶

5、剂稳定中的二硫键，可以提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。性和酸碱稳定性。第36页/共102页通过改变活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性通过改变活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性应用举例：大肠杆菌碱性磷酸酶应用举例：大肠杆菌碱性磷酸酶第37页/共102页E.coli Alkaline phosphatase: Wild Type D101SAsp101Ser101第38页/共102页q易错易错PCR（Error prone PCR）qDNA改组（改组（DNA shuffling）第39页/共102页v易错 PCR（error-prone PCR）是指通过改变PCR反应条件

6、来调整PCR反应中突变的频率,降低聚合酶固有的突变序列倾向性,提高突变谱的多样性,使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中,从而得到随机突变的DNA群体,最后用合适的载体克隆突变基因。v连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。第40页/共102页方法：l增加MgCl2浓度到7mM,稳定非互补的碱基配对l增加聚合酶量到5U,促使在错配碱基处继续延伸反应l降低一种dNTP的量（降至1-10）.在缺乏正确核苷酸时,聚合酶经短暂停留后,会插入另外3种可用核苷酸的一种l加

7、入次黄嘌呤dITP来代替被减少的dNTP,能与C、T、A配对l缓冲液中另加0.5mmol/L MnCl2, Mn2+能降低聚合酶对模板的特异性l增加dCTP和dTTP的浓度到1mM，促进错误掺入l使用突变DNA聚合酶如Mutazyme GCAT第41页/共102页易错PCR(epPCR) 第42页/共102页DNA改组（DNA Shuffling）又称DNA“洗牌”,或DNA体外随机拼接技术,它依赖PCR,又不完全等同于传统的PCR技术,所以,DNA体外随机拼接又称为有性PCR。指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。通过改变单个基因

8、(或基因家族，gene family)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。第43页/共102页DNA shuffling体外基因突变一般过程如下 (1)获得目的基因:选择一组分别具有一系列所需性状的基因序列作为重组的亲本,亲本之间有序列同源性(60%).亲本可以是经随机诱变得到的一组有益突变体,或天然存在的基因家族.常用的有两种方法。n为了增加突变率采用PCR扩增目的基因回收n为了增强保真性，可以采取抽提含有目的基因的质粒，通过酶切回收。第44页/共102页(2)基因酶切回收:采用DNase I消化基因DNA得到10-50 bps或100-300 bps的片段，酶切过程中用M

9、n2+能提高保真性3倍左右。(3)无引物PCR:切割的DNA片段通过相互间的同源随机互补并互为引物,经PCR扩增,获得大量随机组合的新DNA突变体.为确保得到高保真性的片段，应在较高的温度下复性。同标准PCR,先对dsDNA进行热变性,退火时单链片段与足够长度互补序列的其它单链配对,形成3或5突出端,聚合酶延伸3凹端.反复循环，随着循环数增加,片段的平均长度也增加,最后达到DNA亲本序列的原始长度.第45页/共102页(4)有引物PCR:将无引物PCR产物作适当稀释，作为模板进行PCR，加入特定两侧引物进行最后的PCR扩增,便可获得全长基因的PCR产物。(5)目的突变基因的获得:回收目的片段克

10、隆到载体上，转化选择所需的突变了的目的基因。如筛选抗性基因、高酶活基因等第46页/共102页DNase处理无引物PCR 片段重装配3355355355335533反复循环第47页/共102页有引物PCR克隆筛选第48页/共102页DNA Shuffling技术能模拟生物的基因在数百万年间发生的分子进化过程，并能在短期的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高成千上万倍的功能性突变基因。项目项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向常规定向进化进化缓慢缓慢进化进化整个基因组整个基因组 多年多年完整基因完整基因组组高高DNAShuffling快速快速进化进化特定基因特定基因/操纵

11、子操纵子/病病毒毒几天几天部分基因部分基因组组低低DNA Shuffling与常规定向进化的比较第49页/共102页实例:1994年，美国的Stemmer采用单个基因的DNA Shuffling和回交技术，在大肠杆菌中使编码-内酰胺酶的TEM-I基因的抗生素抑制活性(MIC)从0. 02ug/mL提高到640ug/mL,即提高了32, 000倍。次后，他们又相继选取了绿色荧光蛋白基因(gfp)和-半乳糖昔酶基因(lac) (1997)用DNA Shuffling技术模拟并加速了分子进化过程。筛选获得了酶活性大幅度提高的突变株1996年，Moore等亦采用该技术对降解污水中有机污染物的对硝基苄基

12、酯酶基因进行了定向模拟分子进化研究。1998, Crameri等采用4个不同来源的先锋霉素基因混合进行异源基因组的DNA Shuffling，使单一循环的MIC活性提高了270-540倍。而同时只用单一基因进行的实验仅提高了8倍。第50页/共102页交错延伸重组（staggered extension process，StEP）将DNA Shuffling技术进一步改进的DNA体外重组技术核心技术:有性PCR,在一个反应体系中以2个以上有一定序列同源性的DNA片段为模板进行PCR反应,通过变换模板机制实现DNA序列的重新组装第51页/共102页交错延伸重组的一般过程如下 (1)获得目的基因:选

13、择两个以上有一定序列同源性的分别具有优良性状的亲本基因作为PCR模板n省去用DNase将DNA切割成片段及片段纯化步骤,简化了程序(2) 短暂PCR反应 在每轮循环中,退火和延伸反应控制在短暂的时间(5s),引物先在一个模板链上延伸,只能合成出很短的新生链.经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火后继续进行短暂的延伸,此过程反复进行,直到产生全长的基因,得到间隔地含不同模板序列的杂交DNA分子.第52页/共102页(3)两端引物PCR:加入两端引物作标准PCR反应,扩增全长的杂交DNA链。(4)目的突变基因的获得:回收目的片段克隆到载体上，从得到的DNA文库中选择或筛选得到性状优

14、化的基因第53页/共102页第54页/共102页随机引发重组（ random-priming recombination，RPR ）原理:用一套随机引物与模板配对延伸,产生互补于模板不同位点的短DNA片段混合物,由于碱基的错配和错误引发,这些短的DNA片段中也会有少量点突变,在随后的PCR反应中,这些短的DNA片段互为引物重新组装产生全长的基因模板:一条DNA单链或cDNA第55页/共102页随机引发重组的一般过程如下 (1)随机引发合成短DNA片段混合物:以变性DNA为模板,加入随机引物,用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段进行延伸反应,得到长短不一的新生DNA片段(50-500bp)(2

15、) 过滤、纯化DNA片段混合物 去除模板、长的新生DNA片段、小的新生DNA片段（30bp），蛋白质和引物.(3)无引物PCR.新生DNA片段互为引物,重新组装产生全长的杂交DNA链(4)标准PCR 加入特异的两端引物第56页/共102页第57页/共102页第58页/共102页第59页/共102页第60页/共102页第61页/共102页第62页/共102页 生化反应常常需要多酶顺序催化来进行生化反应常常需要多酶顺序催化来进行，称为顺序酶反应（，称为顺序酶反应（Sequence enzyme reaction）。大量的研究表明，通过基因融合构建具有）。大量的研究表明，通过基因融合构建具有双酶活力

16、的融合蛋白双酶活力的融合蛋白，可有效提高顺序酶反，可有效提高顺序酶反应的总转化效率。应的总转化效率。 第63页/共102页黑曲霉葡萄糖氧化酶黑曲霉葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)曲霉糖化酶曲霉糖化酶(Glucoamylase,GA) 第64页/共102页GOD subunitGOD subunitGAGAGLG fusion enzymeLinkerpeptideTranslated fusion peptide chains Expressed fusion enzyme(Ser-Gly)第65页/共102页 融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便地融合蛋白技术

17、的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为“亲和亲和尾尾”（Affinity tail）的编码序列相连接，这段）的编码序列相连接，这段“亲和尾亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，使目标蛋白可使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。融合蛋白标签 第66页/共102页含配体溶液含配体溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未结合的蛋洗下未结合的蛋白白混合蛋白样品混合蛋白样品平衡液平衡液带有配体的树脂带有配体的树脂珠（或胶粒）

18、珠（或胶粒）第67页/共102页第68页/共102页第69页/共102页 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP) )是是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。其内源发光基团在受到紫外或蓝光激发时物发光蛋白。其内源发光基团在受到紫外或蓝光激发时，可高效发射绿光，且无需底物和辅因子。，可高效发射绿光，且无需底物和辅因子。GFP可作为可作为一种一种“荧光标签荧光标签”被用来研究目标蛋白的定位及移动情况被用来研究目标蛋白的定位及移动情况。 第70页/共102页第71页/共102页第7

19、2页/共102页第73页/共102页第74页/共102页第75页/共102页第76页/共102页第77页/共102页第78页/共102页 有机磷水解酶（有机磷水解酶（Organophosphorus hydrolase, OPH）能够降解许多种有机磷农药。将）能够降解许多种有机磷农药。将GFP基因与基因与OPH基因的基因的5端融合，构建端融合，构建GFP-OPH融合基因融合基因，并将其，并将其在大肠杆菌中表达。经在大肠杆菌中表达。经IPTG诱导后，绿色荧光直接可见，诱导后，绿色荧光直接可见，融合蛋白同时保持了融合蛋白同时保持了OPH 和和GFP的生物活性。此外，由的生物活性。此外，由于于GFP

20、的荧光强度与的荧光强度与OPH活力成正比，还可通过荧光强度活力成正比，还可通过荧光强度的检测对的检测对OPH进行定量分析。进行定量分析。 第79页/共102页 控制某一代谢途径的相关基因控制某一代谢途径的相关基因, 紧密连锁地排列在一起紧密连锁地排列在一起.Lac operon I p o Z Y AoperonI:调控基因调控基因 P:启动子启动子O:操纵基因操纵基因 第80页/共102页E. coli: “This is my favorite!”乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖第81页/共102页E. coli: “I needlactose permease,-galactosidas

21、e, andtransacetylase.”第82页/共102页E. coli: “I will use lactose only when there is no glucose and there is lactose.”Glucose + Lactose +Glucose Lactose Glucose Lactose +第83页/共102页The lac operon第84页/共102页第85页/共102页第86页/共102页第87页/共102页第88页/共102页RepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepre

22、ssor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RNAPol.Yipee!第89页/共102页第90页/共102页利用内含肽载体致力生物合成利用内含肽载体致力生物合成C-S酯键酯键肽链或肽链或N-半胱氨酸肽链半胱氨酸肽链内含肽介导的异源蛋白质体外连接内含肽介导的异源蛋白质体外连接用反式剪切技术实现蛋白质体内、体用反式剪切技术实现蛋白质体内、体外连接外连接双内含肽介导的蛋白质自身环化及蛋白双内含肽介导的蛋白质自身环化及蛋白多聚体的生成多聚体的生成内含肽的应