DNA的基本分子生物学操作

1、DNA的基本分子生物学操作（表达载体的构建）胥慧2009.9 突变体突变体 基因缺失或下调基因缺失或下调表达载体的构建btbk转化转化E. coliE. coli构建正确的质粒构建正确的质粒酶切鉴定酶切鉴定转化粗糙脉孢菌转化粗糙脉孢菌Western检测检测表达表达BTBK的菌株的菌株表达载体构建流程零、策略的设计一、PCR扩增基因二、乙醇沉淀基因三、酶切基因及载体四、琼脂糖凝胶电泳回收基因及载体五、连接六、转化大肠杆菌七、质粒的小量提取八、PCR/酶切鉴定及测序九、质粒的大量提取/annotation/genome/neurospora/查找基因查

2、找基因设计引物 引物长度：18-22 nt GC含量 （DNAMAN hybrid: 5060） DNAMAN检查：游离3端 8 bp 以G/C结尾 酶切位点的选择 （巧用平端酶） 保护碱基 负义链引物注意反向 考察是否移码EcoRV (buffer 3)HpaI (4)ScaI (3)SmaI (4)SnaBI (4)StuI (2 1 4)一、PCR（Phusion / Taq）5 X HF buffer: 10 lNEB dNTPs: 0.5 l Phusion: 0.4 l Primer 1: 0.5 l Primer 2: 0.5 l Template: 1 l ddH2O: 37.

3、1 l 98 1 min 98 10 sec 25 X 55 30 sec 72 1 min 72 10 min 10 Notes: 1. Phusion酶的扩增效率为每分钟酶的扩增效率为每分钟24 kb. 2. 最后加酶！现用现取，取出冰浴。最后加酶！现用现取，取出冰浴。一、PCR10 X PCR buffer: 5 lMgCl2: 3 l dNTPs: 0.5 l Taq: 1 l Primer 1: 0.5 l Primer 2: 0.5 l Template: 1 l ddH2O: 38.5 l 94 5 min 94 30 sec 30 X 55 30 sec 72 2 min 72

4、 10 min 10 请爱护请爱护PCR仪！仪！ 反应完及时取出；散热反应完及时取出；散热5分钟；严禁过夜。分钟；严禁过夜。问题篇 P不出来： 从自己操作检查起；负义链引物是否忘记反向了；退火温度是否合适（考虑降温）；换模板；换Taq试；重设引物。大于5 kb的基因考虑分两段。 量太少： 增大模板量；降温；多P几管。 非特异条带： 若目的条带比非特异亮，大胆升温；若非特异比目的带大，严格控制延伸时间；胶回收目的带作模板再PCR。 大小不对： 温度；模板；重设引物。二、乙醇沉淀DNA1. 合并PCR产物，用TE buffer将体系扩大至 200 l，混匀。加入22.5 V无水乙醇、1/10 V醋

5、酸钠(3M, pH 5.2)，混匀。2. 置于-80 30 min以上,或者，液氮速冻。3. 4 12000 rpm离心15 min，倒掉上清。4. 70%乙醇洗沉淀，吸尽上清，烘干。5. 以适量ddH2O溶解DNA。Notes: 离心后迅速倒掉乙醇，切忌反复看到底有没有沉淀；离心后迅速倒掉乙醇，切忌反复看到底有没有沉淀； 可加完可加完70%乙醇后再适当离心；乙醇后再适当离心； 烘干后保持烘干后保持EP管竖直向上；管竖直向上； 充分溶解充分溶解DNA。三、酶切 做酶切前必须研究做酶切前必须研究NEB产品目录！产品目录！EcoRI 25度的 50度的、60度的三、酶切三、酶切 酶切反应体系 50

6、 l体系 5 l体系 buffer 1/2/3/4/U : 5 l 0.5 l DNA: x l a l Enzyme: 1.52 l 0.3 l ddH2O: 补足三、酶切 反应的温度: 大多数酶的最适反应温度是37。 25酶：ApaI SmaI 50酶： 反应时间:（NEB快速酶切产品: 5 min） 一般2 h。 若切末端的几个碱基，延长时间。 研究NEB产品目录！ 三、酶切三、酶切双酶切不同反应温度的酶不可以作双酶切。若两者buffer相同，先切低温酶，再切高温酶；若buffer不同，用分步单酶切。参照NEB双酶切表选择buffer。考察两个酶在建议的buffer中的活性，一般认为活性

7、75%及以上是可取的。不同buffer的酶用分步单酶切代替双酶切。即酶1切乙醇沉淀酶2切，再胶回收。分步酶切质粒时，若两个酶切位点是紧临的，则需考虑留出足够的保护碱基。三、酶切-TTGATGAATTCCTGCAGCCC-AACTACTTAAGGACGTCGGG-EcoRIPstI 酶的星活力： 在非标准条件下切割非特异序列产生非特异片段。产生星活力的原因：甘油 5%；pH 8.0；乙醇残留应对方法：严格按照NEB产品目录（buffer、适合的酶量、温度、时间18 h）三、酶切 注意事项-爱惜、珍惜每一点酶！ 加酶时才去取酶，始终保持酶在冰上，加完酶迅速放回-20！ 酶必须深埋入深埋入-20的冰

8、盒的冰盒！（清理冰霜） 旧酶用完后旧酶用完后“涮涮”管子；保持同一种酶只有一管管子；保持同一种酶只有一管。 新酶用前离心（甩）一下新酶用前离心（甩）一下。 盖子和标签一一对应，不要盖错。三、酶切四、胶回收 琼脂糖凝胶（Agarose） Agarose浓度 分离范围 0.7% 0.812 kb 1.0% 0.510 kb 1.2% 0.47 kb 缓冲液: TAE 贮液：50 X 工作：1 X 制0.8%胶： 0.8 g Agarose 100 ml 1X TAE本实验室常用：0.8% (500 bp 10 kb) 低浓度胶2% ( 1.5 kb )高浓度胶微波化胶降温加5 l EB 电压： 5

9、 V/cm 本实验室：胶回收用90V；检测用120V。 电泳方向： DNA向正极泳动；EB向负极泳动。（跑过的胶的剩孔不宜直接再用） DNA染料EB：高度灵敏的荧光染色剂 302nm 366nm紫外可嵌入DNA碱基间的三环平面基团 1EB/2.5个碱基 加入： 直接加入胶中； 电泳后染色。配置：贮液10mg/ml；工作0.5ug/ml。 5ul EB / 100ml胶 紫外透射反射仪： 长波 360 nm 回收用 短波 254 nm四、胶回收 Loading buffer （6X） 配制6 X loading buffer： 0.25% 溴酚兰 0.25% 二甲苯青 30% 甘油 or 40%

10、 蔗糖 6 X TAE ddH2O 上样时 5 ul DNA + 1ul loading buffer 作用： 增加密度，使DNA沉降；指示前沿 在0.8% Agarose，溴酚兰约相当于0.5 kb的DNA位置； 二甲苯青约相当于5 kb的DNA位置。四、胶回收 Marker四、胶回收 回收胶：配新胶（厚度适中）；换新电泳缓冲液。 切胶时尽量少带空胶 清洗刀片四、胶回收 回收方法： 液氮冻融法 QIAGEN 胶回收试剂盒 Roche 罗氏 Transgene 全氏Notes：1. 溶胶后凉至室温，加1V的异丙醇有助于提高回收效率。2. 溶胶液重复过柱23次。3. 最后洗脱DNA之前稍微干燥一

11、下柱子。4. 洗脱DNA用3550 ul Millipore水，如有必要可重复洗。四、胶回收 跑胶检测两个片段的浓度 连接反应两个片段的比例： 摩尔比vector : insert = 1 : 3 即 : = 1 : 3 例如设需要vector为x ul，跑胶估测浓度80ng/3ul，大小为5.2 kb；需要insert为y ul，跑胶估测浓度120ng/3ul，大小为1 kb。则 : = 1 : 3 五、连接ng insertkb insertng vectorkb vector80 x 5.2120 y 1 连接酶 E. coli DNA ligase T4噬菌体DNA ligase 保存

12、: -20 冰上最多510 min ! 现用现取，用完立即放回！ T4 buffer： 250mM TrisCl (pH 7.6) 50 mM MgCl2 5 mM ATP 5 mM DTT 25% PEG8000五、连接 反应体系 T4 buffer : 0.5 ul vector : x ul insert : y ul T4 ligase : 0.4 ul 25 1h, then 4 1h. （T4连接酶425均可） T4连接酶效率很高，不需要怀疑。五、连接x + y = 4.1 ul六、转化受体菌： JM109 超级感受态 - 转化效率高；生长快。70L感受态细胞中加入5L DNA，混

13、匀，冰浴30min；42热激90秒，快速将管转移到冰上冷却35 min；加入800L液体LB培养基，混匀，37摇床慢摇（100110 rpm）45min使细菌复苏，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；3000 rpm离心10 min。移除750 ul左右的上清，轻柔重悬细胞，将其涂布到含相应抗生素（Amp）的LB平板上。37倒置培养，1016h后可出现菌落。（如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺平板时细菌密度应较低，培养时间不应超过20h，否则会出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落）。1.* 若转化质粒， 第4步不用离心，直接取1050 ul细胞涂板。七、小提质粒 离心收集菌体，尽量除尽培养基； 加100

14、L冰预冷的溶液，Vortex剧烈振荡； 加200L新配制的溶液，加150L冰预冷的溶液，温和颠倒5次； 12000 rpm离心5min，转移上清到新管中； 加2倍体积的无水乙醇沉淀DNA； 12000 rpm离心7min，倒掉上清； 70%乙醇洗涤沉淀，吸尽上清，干燥； 用3050L含RNase A的ddH2O溶解沉淀。（ 如果是过夜摇菌，则最后用50 L。如果是白天摇菌，则用30 L。）八、质粒的鉴定 PCR：P插入片段 酶切鉴定酶切鉴定 测序（Invitrogen公司。可测菌液/质粒/PCR产物） 酶切鉴定：酶的选择 载体和插入片段上都有的酶 可判断出片段插入方向（靠近片段一侧） 酶切产生

15、的条带数为23条，不宜太多 不宜有 500 bp的小条带 优选价格便宜的酶：EcoRV; EcoRI 鉴定用MBI的酶；5或10 ul体系；0.3 ul酶八、质粒的鉴定九、大提质粒50 ml菌液分装到24个离心管，分两次离心收集菌体，尽量除尽培养基；加100L冰预冷的溶液，Vortex剧烈振荡；加200L新配制的溶液，加150L冰预冷的溶液，温和颠倒5次；12000 rpm离心5min，转移上清到新管中；加2倍体积的无水乙醇沉淀DNA； 12000 rpm离心7min，倒掉上清；70%乙醇洗涤沉淀，吸尽上清，干燥；用40L含RNase A的ddH2O溶解沉淀；充分溶解后，合并至2管，加等体积酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，12000 rpm离心3 min，转移上清至新管；加等体积氯仿/异戊醇，振荡混匀，12000 rpm离心3 min，取上清；加等体积的异丙醇、1/10体积的3M NaAc，沉淀DNA； 12000 rpm离心10min，倒掉上清；70%乙醇洗涤沉淀，吸尽上清，干燥；用150250 uL ddH2O溶解沉淀，贮存于-20。表达