章酶细胞固定化PPT学习教案VIP

1、会计学1固定化技术固定化技术第1页/共33页1、什么是固定化技术和固定化酶2、固定化酶的研究历史3、酶的固定化技术4、固定化酶的特点GoGoGoGo6、细胞、原生质体的固定化，自学5、固定化酶的应用Go第2页/共33页5.1 5.1 什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术第3页/共33页化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续酶的固定化技术和固定化酶第4页/共33页固定化酶：经提取和分离纯化后的酶 固定化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片 固定化细胞：在一定的空间范围内

2、进行生命活动的细胞 第5页/共33页本章目录第6页/共33页第7页/共33页本章目录第8页/共33页固定化酶操作的注意事项固定化酶操作的注意事项第9页/共33页第10页/共33页第11页/共33页根据载体材料和方法的不同，可分为：凝胶包埋法凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。 半透膜包埋法半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜

3、、火棉胶膜等 第12页/共33页首先被采用包埋法的是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙烯酰胺，丙烯酰胺，引发剂第13页/共33页海藻酸钙海藻酸钙包埋法装包埋法装置置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控颗粒大小可实时监控第14页/共33页脂质体包裹脂质体包裹第15页/共33页3、结合法、结合法 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固

4、定化方法。定化方法。根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 共价键结合法共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化载体活化，第16页/共33页第17页

5、/共33页第一个离子结合法固定化酶：第一个离子结合法固定化酶：DEAE-CelluloseDEAE-Cellulose固定化过氧化氢酶固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：第一个工业化的固定化酶：DEAE-Sephadex A-50DEAE-Sephadex A-50固定化氨基酰化酶固定化氨基酰化酶第18页/共33页4 4、交联法、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固结合牢固，可

6、以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较颗粒较小小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短使用，以取长补短。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。第19页/共33页酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶本章目录第20页/共33页本章目录第21页/共3

7、3页乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D AlaAminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶世界上第一种工业化生产的固定化酶。世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。 第22页/共33页泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-A

8、laL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala第23页/共33页淀粉液化液淀粉酶糖化酶糖化液喷雾干燥氢化还原结晶异构酶粉状葡萄糖山梨醇结晶葡萄糖果葡糖浆果糖42%葡萄糖55%低聚糖分离混合高果糖浆果糖浆果糖80-90%果糖55%葡萄糖39%低聚糖世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶的放线菌细胞用6065热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。 第24页/共33页第25页/共33页第26页/共33页第27页/共33页葡萄糖醌H2O葡萄糖酸氢醌葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶氢醌 醌2H2ePt铂电

9、极第28页/共33页l葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。 第29页/共33页第30页/共33页脲电极Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电极感应。此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3第31页/共33页一些常见的酶电极一些常见的酶电极底 物酶电 极5腺苷酸5腺苷酸脱氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脱氢酶Pt过氧化物过氧化氢酶Pt (O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt (O2)D-氨基酸D氨基酸氧化酶NH4+L-氨基酸L氨基酸氧化酶NH3蔗糖蔗糖酶+葡萄糖氧化酶Pt (H2O2)琥珀酸琥珀酸脱氢酶Pt (O2)硫酸酯芳