感受态细胞的制备与连接产物转化克隆菌株(1)ppt课件

1、Q&A 关于对照关于对照 关于酶切，衔接关于酶切，衔接感受态细胞的制备感受态细胞的制备 衔接产物转化克隆菌株衔接产物转化克隆菌株 & &制备感受态细胞流制备感受态细胞流 程程预预 培培 养养昨天下午：昨天下午：LBLB培育基培育基3mL3mL，含，含12.5g/mL Tet12.5g/mL Tet37 37 、190rpm190rpm振荡培育过夜振荡培育过夜扩展培育扩展培育(今天早晨：今天早晨：0.4mL0.4mL预培育菌液预培育菌液 40mL LB 40mL LB液体培育基含液体培育基含12.5g/mL Tet12.5g/mL Tet 37 37 、250rpm250rpm振荡培育振荡培育2

2、.5-32.5-3小时小时NovaBlue配制液体并高压配制液体并高压 LBLB液体培育基液体培育基 140mL 140mL 胰蛋白胨胰蛋白胨typtone) 0.8gtyptone) 0.8g 酵母提取物酵母提取物yeast extract) 0.4gyeast extract) 0.4g NaCl 0.8g NaCl 0.8g先加先加80mL80mL水溶解后，再加水溶解后，再加16L 5mol/L NaOH16L 5mol/L NaOH。分装分装40mL40mL到到250mL250mL锥形瓶锥形瓶2 2瓶，其他分装到大瓶，其他分装到大试管中试管中4mL/4mL/管管1414管管 2. LB

3、2. LB固体培育基固体培育基 200 mL 200 mL LB LB液体培育基中含液体培育基中含1.21.2的琼脂，灭菌后待温度的琼脂，灭菌后待温度降到降到6060左右，参与左右，参与50 g/mL Carb50 g/mL Carb、12.5 12.5 g/ mL Tet g/ mL Tet 、70 g/mL X-gal70 g/mL X-gal和和80 mol/L 80 mol/L IPTGIPTG混匀均为终浓度混匀均为终浓度, ,立刻铺平板立刻铺平板1010块块 3. 0.1mol/L3. 0.1mol/L的的CaCl2 100mLCaCl2 100mL两组两组搜集细胞：搜集细胞：终止培

4、育终止培育OD600 0.4-0.5 OD600 0.4-0.5 转移菌液到转移菌液到50mL50mL离心管中，冰浴离心管中，冰浴10min10min离心离心44， 4000rpm 4000rpm 10min 10min ！弃液弃液: : 倒出培育液，将管倒置使培育液流尽倒出培育液，将管倒置使培育液流尽制备感受态：制备感受态：穿孔：参与预冷的穿孔：参与预冷的CaCl2CaCl2 0.1 mol/L 0.1 mol/L，10mL10mL 轻柔吹悬菌体细胞用轻柔吹悬菌体细胞用5 mL5 mL枪头枪头 冰浴冰浴 30min 30min搜集：离心搜集：离心44，4000rpm 4000rpm 5min

5、 5min，弃上清，弃上清保管：预冷的保管：预冷的CaCl2 CaCl2 0.1 mol/L0.1 mol/L， 2mL 2mL 冰上轻柔吹悬菌体细胞冰上轻柔吹悬菌体细胞分装保管：分装保管：200uL/200uL/份份 -20 -20 短期或短期或-70 -70 稍长期冻存稍长期冻存感受态衔接产物转化克隆菌株衔接产物转化克隆菌株1、样品制备、样品制备 用枪头轻柔混匀，冰上放置用枪头轻柔混匀，冰上放置30min实验管实验管阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照1阴性对照阴性对照2感受态细胞感受态细胞（200L） 连接产物连接产物1010L L感受态细胞感受态细胞 （200L ）质粒质粒DNADNA 2

6、 2L L（5 550ng)50ng)感受态细胞感受态细胞（200L） 无菌水无菌水2 2L L0.1 mol/L CaCl0.1 mol/L CaCl2 2 （200L）连接产物连接产物2 2L L 对照的作用？2、转化、转化 42 水浴热激水浴热激90秒秒 冰浴冰浴2分钟分钟3、复苏、复苏 每管加每管加800L LB液体培育基液体培育基 37 慢摇慢摇1小时小时150rpm 4、选择性挑选、选择性挑选 浓缩菌液：离心浓缩菌液：离心4000rpm 1min 吸弃吸弃900uL上清，吹悬剩余细胞上清，吹悬剩余细胞 涂涂 板：板： 取取50uL细胞悬液，涂布在选择平细胞悬液，涂布在选择平板上，板上， 倒置培育过夜倒置培育过夜37 预实验结果预实验结果 阴性对照阴性对照阳性平板阳性平板仪器运用与本卷须知仪器运用与本卷须知离心前，离心前，一定要在一定要在超净台中超净台中绝对平衡绝对平衡！下次实验的简介与预备下次实验的简介与预备质粒的提取质粒的提取重组质粒的酶切分析重组质粒的酶切分析电泳分析重组质粒电泳分析重组质粒重重 组组 质质 粒粒 转转 化化 表表 达达 菌菌 株株重组子的挑选：阳性重组子转化表达菌株重组子的挑选：阳性重组子转化表达菌株 灭菌灭菌1. 1. 小指管：小指管： 1.5 mL 601.5 mL 60个个 2. 2. 枪头：枪头： 200