二张基因工程制药目的基因的分离PPT教案

1、会计学1二张基因工程制药目的基因的分离二张基因工程制药目的基因的分离2第1页/共57页3第一节第一节 分离目的基因的方法及原理分离目的基因的方法及原理1第2页/共57页4第3页/共57页5 第4页/共57页第5页/共57页7第6页/共57页8第7页/共57页9区段的杂交细区段的杂交细胞株分离胞株分离RNA,RNA,反转录合成反转录合成cDNAcDNA第8页/共57页10细胞为材料，细胞为材料，提取提取RNARNA，构，构成成cDNAcDNA文库。文库。第9页/共57页11第10页/共57页12第11页/共57页13第12页/共57页第13页/共57页15第14页/共57页方法：合成cDNA第一

2、链 5AAAAAA 3 mRNA TTTTTTT 5 cDNA 1 Oligo(dT)，反转录酶 d NTP, 合成cDNA第二链 AAAAAA 3 cDNA 2 TTTTTTT 5 RNase H，DNA聚合酶, dNTP 5 AAAAAA 3 双链 cDNA 3 TTTTTTT 5第15页/共57页第16页/共57页第17页/共57页19第18页/共57页20第19页/共57页21第20页/共57页22第21页/共57页23第22页/共57页24第23页/共57页25第24页/共57页2623第25页/共57页27第26页/共57页28第27页/共57页29第28页/共57页30第29页/

3、共57页314第30页/共57页32第31页/共57页F细胞mRNA。 F细胞中特异表达的cDNA文库（即差示文库）（F细胞cDNA第一链）代表F细胞特异表达的基因（H细胞mRNA） 。 。 。第32页/共57页34第33页/共57页35第34页/共57页36第35页/共57页37第36页/共57页38第37页/共57页39第38页/共57页40 第39页/共57页41第40页/共57页42第41页/共57页5GAGTCACACTTGAC 3待测单链DNA 3CTG 5引物、Klenow酶、d AT P 、 d G T P 、dCTP、dTTP和少量-32P-dATP 加ddATP反应3ACT

4、G 53AACTG 53AGTGTGAACTG 5加ddCTP反应3CAGTGTGAACTG 53CTCAGTGTGAACTG5加ddTTP反应3TGAACTG 53TGTGAACTG 53TCAGTGTGAACTG5加ddGTP反应3GAACTG 53GTGAACTG 53GTGTGAACTG5GAGTCACACTT变性凝胶电泳、放射自显影 A C T G 5第42页/共57页44第43页/共57页45第44页/共57页46第45页/共57页47与靶与靶DNADNA链序列互补的寡核苷链序列互补的寡核苷酸酸第46页/共57页48第47页/共57页49第48页/共57页50 原理原理 使特定的碱

5、基首先被化学修饰，然后再经化学使特定的碱基首先被化学修饰，然后再经化学处理。如：用硫酸二甲酯使鸟嘌呤甲基化，然处理。如：用硫酸二甲酯使鸟嘌呤甲基化，然后再加哌啶，使甲基化的鸟嘌呤丢失，后再加哌啶，使甲基化的鸟嘌呤丢失，DNADNA链链从鸟嘌呤修饰处后的从鸟嘌呤修饰处后的3 3，5 5- -磷酸二酯键断裂。磷酸二酯键断裂。第49页/共57页51 自动测序仪基于自动测序仪基于2 2，3-3-双脱氧末端终止法的原双脱氧末端终止法的原理，标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号理，标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧的荧光染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷酸共价相连，使其带有不同的荧光标记核苷三磷酸共价相连，使其带有不同的荧光标记。当某一种。当某一种ddNTPddNTP掺入到正在合成的掺入到正在合成的DNADNA单链分单链分子中时，该链的延伸便终止并带有相应的荧光染子中时，该链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。料。 自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装置、计算机成像系统及分析软件组合。置、计算机成像系统及分析软件组合。6第50页/共57页52序序 列列 图图 谱谱(ABI PRISM 37