酶工程02酶的生产

1、第三章第三章 酶的生产酶的生产 酶是由活细胞产生的有活性的蛋白质，酶来酶是由活细胞产生的有活性的蛋白质，酶来自于生物体，早期酶的来源主要来自动植物细胞，自于生物体，早期酶的来源主要来自动植物细胞，以后多用以后多用微生物细胞微生物细胞制取酶。随着制取酶。随着动植物细胞动植物细胞大大规模培养技术的发展，从这些动植物细胞中制取规模培养技术的发展，从这些动植物细胞中制取酶被人们重视起来。酶被人们重视起来。但是不管用何种细胞，都应具备下述条件：但是不管用何种细胞，都应具备下述条件：（1）酶产量高）酶产量高 （2）易培养管理）易培养管理（3）产酶性能稳定）产酶性能稳定（4）利于酶产品分离纯化）利于酶产品分

2、离纯化（5）安全可靠）安全可靠第一节第一节 酶的生产菌种酶的生产菌种 只要进行生产发酵，就必须有适宜的只要进行生产发酵，就必须有适宜的菌种菌种，菌，菌种是发酵生产酶的最重要条件，菌种的优劣，直接种是发酵生产酶的最重要条件，菌种的优劣，直接关系到酶的产量和质量。关系到酶的产量和质量。目前大多数食品工业微生物的生产仅限于目前大多数食品工业微生物的生产仅限于11种真菌，种真菌，8种细菌和种细菌和4种酵母菌，投入工业发酵生产的酶也不种酵母菌，投入工业发酵生产的酶也不过五、六十种（教材过五、六十种（教材P38表表31 32）一一 对生产菌的要求对生产菌的要求 虽然每一种酶往往可以从多种微生物中得到，但是

3、作为酶虽然每一种酶往往可以从多种微生物中得到，但是作为酶制剂的生产菌必须考虑以下要求：制剂的生产菌必须考虑以下要求：1.不是致病菌不是致病菌，在系统发育上应与病源体无关不产生毒素。，在系统发育上应与病源体无关不产生毒素。这一点对于食品用酶和医药用酶工业尤其重要，在采用一个新这一点对于食品用酶和医药用酶工业尤其重要，在采用一个新的产酶菌株时，应先取得大量的病理和或动物饲喂试验数据作的产酶菌株时，应先取得大量的病理和或动物饲喂试验数据作为基础。美国同意使用的食品用酶见表为基础。美国同意使用的食品用酶见表34（P41）2.菌种不易变异退化，不易感染噬菌体菌种不易变异退化，不易感染噬菌体。3.产酶量高

4、产酶量高，酶的性质符合应用的要求，且最好是产胞外酶的，酶的性质符合应用的要求，且最好是产胞外酶的菌。菌。4.能利用廉价的原料，发酵周期短，能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养易培养。总之，对菌种的要求是一个产酶全过程的总体考虑，各个环总之，对菌种的要求是一个产酶全过程的总体考虑，各个环节必须能重复利用。节必须能重复利用。1977年，联合国粮农组织（农业粮食组织年，联合国粮农组织（农业粮食组织FAO）和世界卫生）和世界卫生组织组织WHO的食品添加剂专家联合委员会（的食品添加剂专家联合委员会（JECFA)就有关酶就有关酶的生产向的生产向21届大会提出了如下建议：届大会提出了如下建议：1.凡是从动植

5、物可食部分或用传统食品加工的微生物所产生凡是从动植物可食部分或用传统食品加工的微生物所产生的酶，可作为食品对待，不必进行毒物学研究，只需建立有的酶，可作为食品对待，不必进行毒物学研究，只需建立有关酶化学和微生物学的详细说明关酶化学和微生物学的详细说明2.凡是由非致病的一般食品污染微生物所制取的酶需作短期凡是由非致病的一般食品污染微生物所制取的酶需作短期毒性试验，毒性试验，3.由非常见微生物制取的酶，应作广泛的毒性试验，包括慢由非常见微生物制取的酶，应作广泛的毒性试验，包括慢性中毒在内，食品酶制剂的毒性试验需按表性中毒在内，食品酶制剂的毒性试验需按表33进行。进行。 一般而言，酶作为天然提取物可

6、以认为是安一般而言，酶作为天然提取物可以认为是安全的，真正有毒性的酶是罕见的，某些酶制剂之全的，真正有毒性的酶是罕见的，某些酶制剂之所以有毒性，是因为酶分离纯化的不够，含有微所以有毒性，是因为酶分离纯化的不够，含有微生物及环境中的一些致病毒素，因此酶制剂在生生物及环境中的一些致病毒素，因此酶制剂在生产时，要通过安全检查。检查项目及指标见表产时，要通过安全检查。检查项目及指标见表35。(P42)二二 生产菌的获得生产菌的获得 除了从菌种保藏机构和有关研究部门获得外，一般除了从菌种保藏机构和有关研究部门获得外，一般都要通过筛选得到。筛选包括以下环节：都要通过筛选得到。筛选包括以下环节：菌样采集，菌

7、菌样采集，菌种分离、纯化和生产性能鉴定种分离、纯化和生产性能鉴定。（一）菌样采集（一）菌样采集菌的分布大体有如下规律菌的分布大体有如下规律1.菌种越相近，其产生的酶在性质上一般也越相近或菌种越相近，其产生的酶在性质上一般也越相近或相似。相似。2.胞外酶活性的最适条件与稳定性和菌生长的最适条胞外酶活性的最适条件与稳定性和菌生长的最适条件相一致。件相一致。3.要得到具有降解某物质的酶的生产菌，可以从该物要得到具有降解某物质的酶的生产菌，可以从该物质比较丰富的地方去寻找。质比较丰富的地方去寻找。 （二）菌种分离纯化（二）菌种分离纯化菌种分离纯化有两种方式，即菌种分离纯化有两种方式，即平板划线法平板划

8、线法和和直接稀释直接稀释法法。如：木质素酶、纤维素酶等菌种可在森林或木材堆如：木质素酶、纤维素酶等菌种可在森林或木材堆积的地方获得；分解尿酸酶的菌种，可以从鸡棚鸡积的地方获得；分解尿酸酶的菌种，可以从鸡棚鸡粪堆中分离得到；而降解某些合成物质的产酶菌，粪堆中分离得到；而降解某些合成物质的产酶菌，可从污水处理厂获得。可从污水处理厂获得。（三）菌种生产性能鉴定（三）菌种生产性能鉴定包括包括初选和复选初选和复选初选：从已分离出来的菌种中筛选具有所需要酶的菌种（定初选：从已分离出来的菌种中筛选具有所需要酶的菌种（定性）性）复选：在初选的基础上选出产酶量高，性能符合要求的菌种。复选：在初选的基础上选出产酶

9、量高，性能符合要求的菌种。初选要求方法快速，简便。复选则要求测定方法相对准确。初选要求方法快速，简便。复选则要求测定方法相对准确。方法：方法：初选采用平板培养透明圈法：如在筛选水解酶的生产菌时，初选采用平板培养透明圈法：如在筛选水解酶的生产菌时，可将酶的底物作为主要的碳源和氮源加入培养基中，若某菌可将酶的底物作为主要的碳源和氮源加入培养基中，若某菌种能产生所需要的酶，则在培养相当时间后，就会在该菌落种能产生所需要的酶，则在培养相当时间后，就会在该菌落周围形成透明的水解圈，从圈的大小可大致判断该菌种的产周围形成透明的水解圈，从圈的大小可大致判断该菌种的产酶能力，通过比较不同培养条件下透明圈的大小

10、，可大致了酶能力，通过比较不同培养条件下透明圈的大小，可大致了解该产酶菌对培养条件的要求。解该产酶菌对培养条件的要求。复筛：将产酶能力较强的菌移入三角瓶内，振荡培养，然复筛：将产酶能力较强的菌移入三角瓶内，振荡培养，然后用生产上常规的测定方法，对培养液进行分析鉴定，找后用生产上常规的测定方法，对培养液进行分析鉴定，找出产酶量最高，性能上符合要求的菌株。由于摇瓶条件和出产酶量最高，性能上符合要求的菌株。由于摇瓶条件和发酵罐条件大致相同，所以测得的结果通常能反映产酶菌发酵罐条件大致相同，所以测得的结果通常能反映产酶菌实际生产能力。实际生产能力。 一般说来，在优良菌种的获得上，好的菌种来源和有一般说

11、来，在优良菌种的获得上，好的菌种来源和有效的筛选方法的结合是成功的关键。效的筛选方法的结合是成功的关键。三三 产酶菌的培养产酶菌的培养获得了好的菌株后，还必须有适宜的发酵条件和发酵方法，获得了好的菌株后，还必须有适宜的发酵条件和发酵方法，目的是获得高的产酶量。目的是获得高的产酶量。（一）菌种制备（一）菌种制备为了保持产酶菌株的优良性能，必须注意的是为了保持产酶菌株的优良性能，必须注意的是1.为减少污染，应尽量减少传代次数，直接用固定斜面菌种为减少污染，应尽量减少传代次数，直接用固定斜面菌种接种种子瓶。接种种子瓶。2.种子培养基和发酵培养基大致相似，种子培养基高温灭菌种子培养基和发酵培养基大致相

12、似，种子培养基高温灭菌时间不宜过长，温度不宜过高，否则可能妨害菌株的生长。时间不宜过长，温度不宜过高，否则可能妨害菌株的生长。3.种子培养时间从种子培养时间从1018小时不等，依据菌种和培养条件而小时不等，依据菌种和培养条件而定，检测的参数包括：定，检测的参数包括：pH变化，菌体量，二氧化碳的生产变化，菌体量，二氧化碳的生产及酶活力情况。及酶活力情况。（二）发酵方法二）发酵方法1 .固体发酵法固体发酵法这是以麸皮，米糠等为基本原料，再加入无机盐和适量的水这是以麸皮，米糠等为基本原料，再加入无机盐和适量的水分（通常分（通常50左右）进行的一种培养，设备简单，便于应用。左右）进行的一种培养，设备简

13、单，便于应用。最常用的是最常用的是浅盘法浅盘法，培养基厚度一般不宜超过，培养基厚度一般不宜超过5厘米厘米.2.液体发酵法液体发酵法：这是用合成的液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌通气培这是用合成的液体培养基，在发酵罐内进行的一种搅拌通气培养法，是目前酶制剂和其他发酵产品生产的主要培养方式。养法，是目前酶制剂和其他发酵产品生产的主要培养方式。但是需要一定的设备和技术条件，动力消耗大，原料利用率和但是需要一定的设备和技术条件，动力消耗大，原料利用率和产量高，发酵条件易控制。产量高，发酵条件易控制。（1）间歇发酵）间歇发酵先在适于菌体生长的条件下进行培养，然后再转先在适于菌体生长的条件下进行培养，

14、然后再转入适于产酶的条件下进行发酵，可以将菌体的入适于产酶的条件下进行发酵，可以将菌体的生长条件区别对待，并根据各阶段的特点提供生长条件区别对待，并根据各阶段的特点提供相应的最适条件，所以产酶率高，同时营养物相应的最适条件，所以产酶率高，同时营养物质和诱导物质浪费很少。质和诱导物质浪费很少。（2）连续发酵法）连续发酵法 先将菌体培养至某一生长期（如对数期），然后一先将菌体培养至某一生长期（如对数期），然后一方面连续加入新鲜培养基，另一方面又不断的以相同速度方面连续加入新鲜培养基，另一方面又不断的以相同速度放出培养产物，且使二者的速度和生长速度一致，目的是放出培养产物，且使二者的速度和生长速度一

15、致，目的是使菌体生长处于恒定条件下。使菌体生长处于恒定条件下。优点是：大大提高劳动生产率，同时可打破酶合成时的反优点是：大大提高劳动生产率，同时可打破酶合成时的反馈阻遏，提高产酶率。馈阻遏，提高产酶率。本法的关键是应避免杂菌。本法的关键是应避免杂菌。第二节第二节 酶的发酵技术酶的发酵技术 发酵条件既影响菌体的繁殖，又影响酶的形成。发酵条件既影响菌体的繁殖，又影响酶的形成。因因此在选择发酵条件时，这二者都要兼顾到，一般情况下此在选择发酵条件时，这二者都要兼顾到，一般情况下先确定菌体生长的最佳条件，然后再调整各种因素，满先确定菌体生长的最佳条件，然后再调整各种因素，满足酶的生成需要。足酶的生成需要

16、。一、培养基的营养成分一、培养基的营养成分在发酵条件中培养基组成对菌的生长和酶的合成有最直接在发酵条件中培养基组成对菌的生长和酶的合成有最直接的影响。因为培养基作为营养成分是微生物发酵产酶的直的影响。因为培养基作为营养成分是微生物发酵产酶的直接原料，主要包括：接原料，主要包括：碳源、氮源、无机盐、生长因子、产碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶促进剂等。酶促进剂等。（一）碳源（一）碳源1.构成菌体物质的主要物质元素（蛋白质、糖、脂、核酸等）构成菌体物质的主要物质元素（蛋白质、糖、脂、核酸等）2.为微生物生长发育提供能量。为微生物生长发育提供能量。3.为菌体贮藏和生产代谢产物所需。为菌体贮藏和生产

17、代谢产物所需。不同的微生物对碳源的利用能力是不同的。如生产葡萄糖异构酶不同的微生物对碳源的利用能力是不同的。如生产葡萄糖异构酶的链霉菌要求碳源为的链霉菌要求碳源为D-核糖或木聚糖；生产脂肪酶的假丝酵母核糖或木聚糖；生产脂肪酶的假丝酵母却只有用葡萄糖为碳源才能产酶。生产分解代谢有关的酶类时，却只有用葡萄糖为碳源才能产酶。生产分解代谢有关的酶类时，一般不宜用葡萄糖之类的易被利用的碳源作培养基，也不宜使用一般不宜用葡萄糖之类的易被利用的碳源作培养基，也不宜使用太丰富的碳源，否则可能会导致分解代谢产物阻遏。太丰富的碳源，否则可能会导致分解代谢产物阻遏。某些碳源是酶的诱导物，选择适宜的碳源即可提高相应酶

18、的产量，某些碳源是酶的诱导物，选择适宜的碳源即可提高相应酶的产量，也利于定向地促进某些酶的合成。如淀粉可诱导淀粉酶的合成。也利于定向地促进某些酶的合成。如淀粉可诱导淀粉酶的合成。（二）氮源（二）氮源作用：是构成菌体蛋白和核酸的重要元素。作用：是构成菌体蛋白和核酸的重要元素。各种微生物对氮源的要求也很复杂，各种微生物对氮源的要求也很复杂，有的菌生长和产酶以有有的菌生长和产酶以有机态机态N效果较好，有的利用无机态效果较好，有的利用无机态N效果较好效果较好。除此之外，。除此之外，N源的具体性质，使用浓度都可能对菌的生长和酶的合成带来源的具体性质，使用浓度都可能对菌的生长和酶的合成带来不同程度的影响。

19、不同程度的影响。C/N比比在某些情况下也能影响菌的生长和产酶，如低的在某些情况下也能影响菌的生长和产酶，如低的C/N比比利于提高蛋白酶的产量，但是往往会使培养后期利于提高蛋白酶的产量，但是往往会使培养后期pH向碱性方向碱性方向变化，反过来再阻遏蛋白酶的积累，为此应当综合考虑碳向变化，反过来再阻遏蛋白酶的积累，为此应当综合考虑碳源、氮源、及源、氮源、及C/N比。比。来源：有机态来源：有机态N - 豆饼、豆饼、 棉子皮等棉子皮等 无机态无机态N- 硫酸氨硫酸氨 、氯化氨等、氯化氨等（三）金属离子及相对应的阴离子三）金属离子及相对应的阴离子作用：作用：1.参加细胞物质的组成。参加细胞物质的组成。2.

20、作为酶的活性组分或活化剂起作用。在酶的合成过程中可以作为酶的活性组分或活化剂起作用。在酶的合成过程中可以起促进或阻遏作用，如钴离子能促进葡萄糖异构酶的生成，起促进或阻遏作用，如钴离子能促进葡萄糖异构酶的生成，但二价锰离子，二价铁离子、钙离子却相反。但二价锰离子，二价铁离子、钙离子却相反。值得注意的是：离子浓度和性质具有关键作用值得注意的是：离子浓度和性质具有关键作用如如Co 2+ 5103 M时阻遏开始起主要作用。时阻遏开始起主要作用。一般来说自来水和原料中都含有一些所需离子，不需另加，一般来说自来水和原料中都含有一些所需离子，不需另加，但其影响作用一定引起重视。但其影响作用一定引起重视。（四

21、）生长因子（四）生长因子作用：构成辅酶的成分，对微生物代谢活动具有调节作用。作用：构成辅酶的成分，对微生物代谢活动具有调节作用。其中主要的是其中主要的是B族维生素，对酶的活力影响非常大。产酶菌族维生素，对酶的活力影响非常大。产酶菌在缺乏某种生长因子的培养基中，虽然可以长得很好，酶蛋在缺乏某种生长因子的培养基中，虽然可以长得很好，酶蛋白合成也不受影响，但是合成的酶往往不具活力。有时在某白合成也不受影响，但是合成的酶往往不具活力。有时在某些产酶菌培养过程中，添加某种生长因子，可提高酶产量。些产酶菌培养过程中，添加某种生长因子，可提高酶产量。玉米浆，酵母膏，麦芽浸液等天然物质中都含生长因子，所玉米浆

22、，酵母膏，麦芽浸液等天然物质中都含生长因子，所以一般也不另外添加。以一般也不另外添加。（五）产酶促进剂（五）产酶促进剂广义的讲：凡是能显著提高酶产率的物质都叫产广义的讲：凡是能显著提高酶产率的物质都叫产酶促进剂。酶促进剂。侠义地讲：就是除了上述生长基本因素以外的物侠义地讲：就是除了上述生长基本因素以外的物质。大体上可以分为两类：质。大体上可以分为两类：1.诱导物诱导物2.表面活性剂表面活性剂：主要作用是增加细胞的通透性，：主要作用是增加细胞的通透性，改善氧的传递速度，分为离子型和非离子型，因改善氧的传递速度，分为离子型和非离子型，因为离子型对微生物有害，所以常用的表面活性剂为离子型对微生物有害

23、，所以常用的表面活性剂是非离子型。是非离子型。二二 发酵条件对产酶的影响发酵条件对产酶的影响（一）温度对产酶的影响（一）温度对产酶的影响培养温度不仅能影响菌的生长，同样能影响酶的培养温度不仅能影响菌的生长，同样能影响酶的合成。比较多的情况是产酶菌在低于最适生长温合成。比较多的情况是产酶菌在低于最适生长温度条件下，酶产量一般比较高。如用酱油曲霉生度条件下，酶产量一般比较高。如用酱油曲霉生产蛋白酶时产蛋白酶时28oC培养时的产量比培养时的产量比40oC培养时高培养时高23倍，而以倍，而以20oC时产量最高，产酶的最适温度因发时产量最高，产酶的最适温度因发酵方式不同差异很大。酵方式不同差异很大。另外

24、，培养温度也可能直接影响到生成的酶的活另外，培养温度也可能直接影响到生成的酶的活力及稳定性，特别是影响酶的耐热性。力及稳定性，特别是影响酶的耐热性。（二）二）pH对产酶的影响对产酶的影响pH对产酶影响很大。对绝大多数水解酶来说，产酶的对产酶影响很大。对绝大多数水解酶来说，产酶的最适最适pH常与酶作用的最适常与酶作用的最适pH相近，但是有些水解酶和相近，但是有些水解酶和氧化酶产酶率最高的氧化酶产酶率最高的pH和酶作用的最适和酶作用的最适pH相距很远。相距很远。很多微生物能同时生产几种酶，控制培养基的很多微生物能同时生产几种酶，控制培养基的pH ，常，常可影响各种酶之间的比例，培养基的可影响各种酶

25、之间的比例，培养基的pH变化，常有利变化，常有利于那些能形成中和介质的酶类生成。如大肠杆菌在高于那些能形成中和介质的酶类生成。如大肠杆菌在高pH下，合成的是氨基酸脱羧酶；在低的下，合成的是氨基酸脱羧酶；在低的pH条件下，则条件下，则促进氨基酸脱氨酶的形成。促进氨基酸脱氨酶的形成。培养基的培养基的pH和培养基的组成有关和培养基的组成有关。如。如C/N高，则高，则pH偏酸，反之偏碱或中性，硫酸氨是生理酸性偏酸，反之偏碱或中性，硫酸氨是生理酸性N源，源，而硝酸钠是生理碱性而硝酸钠是生理碱性N源，作为源，作为N源被消耗后，剩下源被消耗后，剩下的离子显然会引起培养基的离子显然会引起培养基pH的改变。的改

26、变。另外另外pH还和通气量有关还和通气量有关，通气量足，糖、脂氧化完，通气量足，糖、脂氧化完全，对全，对pH影响小；通气量不足，氧化不完全，中间影响小；通气量不足，氧化不完全，中间产物许多是有机酸，使产物许多是有机酸，使pH下降。下降。（三）通风量对产酶的影响（三）通风量对产酶的影响由于大多数产酶菌都是好气菌，所以调节通气量对由于大多数产酶菌都是好气菌，所以调节通气量对提高产酶量非常重要。提高产酶量非常重要。通气的主要目的是：一是供给氧，二是带走多余的通气的主要目的是：一是供给氧，二是带走多余的热。一般来说，在液体深层发酵时较小的通气量有热。一般来说，在液体深层发酵时较小的通气量有利于霉菌孢子

27、萌发和菌体生长，较大的通气量可促利于霉菌孢子萌发和菌体生长，较大的通气量可促进酶的形成，固体发酵有不同的规律，菌体生长要进酶的形成，固体发酵有不同的规律，菌体生长要求通以空气，较小的通气量就能显著提高酶产量。求通以空气，较小的通气量就能显著提高酶产量。（四）搅拌的影响（四）搅拌的影响搅拌的目的：搅拌的目的：1.有利于热交换有利于热交换2.有利于营养物质充分利用有利于营养物质充分利用3.利于溶氧利于溶氧但是一定要控制好搅拌速度，不同的菌体，不同的生长产酶期等但是一定要控制好搅拌速度，不同的菌体，不同的生长产酶期等要注意不同的速度。要注意不同的速度。（五）泡沫的影响（五）泡沫的影响（六）湿度的影响

28、（六）湿度的影响第三节第三节 提高酶产量的方法提高酶产量的方法酶产量受到酶合成调节的控制酶产量受到酶合成调节的控制，因此要提高酶产量，就要，因此要提高酶产量，就要了解调控机制，从而打破这种调控机制，酶的合成和其他了解调控机制，从而打破这种调控机制，酶的合成和其他蛋白一样，也服从中心发则。是蛋白一样，也服从中心发则。是在各种水平（复制、转录、在各种水平（复制、转录、翻译和翻译后加工）上进行调控的翻译和翻译后加工）上进行调控的。对于真核生物细胞来。对于真核生物细胞来说，调控机制比原核细胞要复杂的多，说，调控机制比原核细胞要复杂的多，除了在细胞水平上除了在细胞水平上调节外，还有组织水平，器官水平，神

29、经水平和激素水平，调节外，还有组织水平，器官水平，神经水平和激素水平，昼夜周期等昼夜周期等，所以，以动植物细胞产酶，总的来说要比原，所以，以动植物细胞产酶，总的来说要比原核细胞生物产酶复杂的多，在原核生物中，转录和翻译过核细胞生物产酶复杂的多，在原核生物中，转录和翻译过程紧密相连，其程紧密相连，其mRNA的半衰期近的半衰期近1分钟，酶的合成主要分钟，酶的合成主要取决于转录速度，调控的环节主要是转录水平，且比真核取决于转录速度，调控的环节主要是转录水平，且比真核生物了解的清楚。生物了解的清楚。一一 酶合成的调节机制酶合成的调节机制操纵子（操纵子（operon)Jacob和和 Monod于于196

30、0年提出操纵子学说，年提出操纵子学说，1966年发年发现了启动基因使这一调节控制理论不断完善。现了启动基因使这一调节控制理论不断完善。根据这一理论，在根据这一理论，在DNA分子中与酶生物合成有密切关分子中与酶生物合成有密切关系的基因有四种分别是系的基因有四种分别是调节基因调节基因（regulator gene)、启启动基因动基因(promoter gene)、操纵基因操纵基因(operator gene)和和结结构基因构基因(strucrtural gene)。 结构基因上的遗传信息可转录成结构基因上的遗传信息可转录成mRNA上的遗传上的遗传密码，操纵基因可以特异的与调节基因产生的变构蛋密码，

31、操纵基因可以特异的与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）结合，从而操纵酶合成的时机与速度。白（阻遏蛋白）结合，从而操纵酶合成的时机与速度。结构基因与操纵基因一起称为操纵子，启动基因决定结构基因与操纵基因一起称为操纵子，启动基因决定酶的合成能否开始，启动基因有两个组成位点，一是酶的合成能否开始，启动基因有两个组成位点，一是RNA聚合酶结合位点，另一个是聚合酶结合位点，另一个是cAMP与环腺苷酸接与环腺苷酸接受蛋白（受蛋白（CRP)的复合物（的复合物（ cAMP CRP）结合位点，）结合位点，只有在只有在cAMP CRP结合到启动基因的位点上结合到启动基因的位点上时时,RNA聚合酶才能结合到启动基因

32、的位点上，这样聚合酶才能结合到启动基因的位点上，这样酶的合成才能开始，否则不能合成。酶的合成才能开始，否则不能合成。 调节基因可以产生一种阻遏蛋白，他可以通过与调节基因可以产生一种阻遏蛋白，他可以通过与的分子作用物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变的分子作用物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改变他与操纵基因的结合力，当阻遏蛋其结构，从而改变他与操纵基因的结合力，当阻遏蛋白结合到操纵基因上时，白结合到操纵基因上时，RNA聚合酶即使结合到启聚合酶即使结合到启动基因位点上，也无法启动转录，只有当阻遏蛋白变动基因位点上，也无法启动转录，只有当阻遏蛋白变构而不与操纵基因结合时，构而不与操纵

33、基因结合时，RNA聚合酶才能通过操聚合酶才能通过操纵基因到达结构基因位置，进行转录、翻译为蛋白质。纵基因到达结构基因位置，进行转录、翻译为蛋白质。基因对酶生物合成的调节控制有三种模式即：基因对酶生物合成的调节控制有三种模式即：分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用，酶合成的诱导作用酶合成的诱导作用及及酶合成的酶合成的反馈阻遏作用反馈阻遏作用.ayzopiocAMP-CAP是正调控因子，阻遏蛋白是负调控因子。是正调控因子，阻遏蛋白是负调控因子。控制位点控制位点结构基因结构基因调节基因调节基因乳糖操纵子乳糖操纵子aoiCAP与与cAMP形成复合物，结形成复合物，结合在合在lac operon的启动基

34、因上，的启动基因上，促进转录的进行。促进转录的进行。诱导物诱导物诱导物诱导物-阻遏阻遏蛋白复合物蛋白复合物（一）分解代谢物阻遏作用（一）分解代谢物阻遏作用 指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。如葡萄糖阻遏成的现象。如葡萄糖阻遏半乳糖苷酶的生物合成，果半乳糖苷酶的生物合成，果糖阻遏糖阻遏淀粉酶的生物合成。这是因为容易利用的碳源淀粉酶的生物合成。这是因为容易利用的碳源过量时，通过代谢途径进行降解放出能量，一部分贮存在过量时，通过代谢途径进行降解放出能量，一部分贮存在ATP中（中（ADP+AMP-ATP)这样，这样，ATP在胞内增

35、加，在胞内增加，AMP下降，由于下降，由于cAMP可生成可生成AMPcAMP+H2O-AMP(反应自左向右进行）反应自左向右进行）同时同时cAMP生成受阻，使细胞中的生成受阻，使细胞中的cAMP的浓度随的浓度随AMP的的降低而降低，导致降低而降低，导致cAMP-CRP降低，结果在降低，结果在P上没有上没有cAMP-CRP复合物结合，复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到启聚合酶也就无法结合到启动基因的位点上，使结构基因上的遗传信息无法转录，酶动基因的位点上，使结构基因上的遗传信息无法转录，酶无法合成。无法合成。 当易利用的碳源不存在或被细胞用完后，细胞中当易利用的碳源不存在或被细胞用完后，细胞

36、中随随ATP的下降，使的下降，使ADP AMP cAMP浓度增加，浓度增加，当当cAMPCRP达到一定量时，达到一定量时， cAMPCRP复合复合物结合到启动基因特定的位点上，物结合到启动基因特定的位点上，RNA聚合酶也聚合酶也结合到它的位点上，酶合成即可进行。结合到它的位点上，酶合成即可进行。 由此可知，分解代谢阻遏作用及该作用的解除，由此可知，分解代谢阻遏作用及该作用的解除，实质上是实质上是cAMP通过启动基因对酶生物合成的调节通过启动基因对酶生物合成的调节控制。控制。 为此，在培养基中控制好容易利用的碳源的量，为此，在培养基中控制好容易利用的碳源的量，或在容易利用的碳源过剩时，加进一定量

37、的或在容易利用的碳源过剩时，加进一定量的cAMP，均可防止或解除分解代谢物阻遏作用。均可防止或解除分解代谢物阻遏作用。（二）酶合成的诱导作用（二）酶合成的诱导作用 加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程叫酶合成的诱导作用，简称诱导作用，起诱导作用的物质叫叫酶合成的诱导作用，简称诱导作用，起诱导作用的物质叫诱导剂。如乳糖诱导诱导剂。如乳糖诱导半乳糖苷酶的合成；淀粉诱导半乳糖苷酶的合成；淀粉诱导淀淀粉酶的合成等粉酶的合成等（三）酶生物合成的反馈阻遏作用（三）酶生物合成的反馈阻遏作用 这种作用又称产物阻遏作用，指酶催化作用的产物或代谢这种作用

38、又称产物阻遏作用，指酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程，引起反馈阻遏途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程，引起反馈阻遏作用的物质叫共阻遏物。如无机磷酸是碱性磷酸酶催化磷酸单作用的物质叫共阻遏物。如无机磷酸是碱性磷酸酶催化磷酸单脂水解的产物，而它的过量存在却可以阻遏碱性磷酸酶的生物脂水解的产物，而它的过量存在却可以阻遏碱性磷酸酶的生物合成；组氨酸作为组氨酸合成途径的终产物，它的过量积累可合成；组氨酸作为组氨酸合成途径的终产物，它的过量积累可反过来对其合成途径中的反过来对其合成途径中的10种酶的生物合成均起反馈阻遏作用。种酶的生物合成均起反馈阻遏作用。其机理与诱导机

39、理相似。其机理与诱导机理相似。 在无共阻遏物时，调节基因在无共阻遏物时，调节基因R产生的阻遏蛋白产生的阻遏蛋白与操纵基因与操纵基因O的亲和力弱，不能与的亲和力弱，不能与O结合，所以已结合，所以已经结合到经结合到P上的上的RNA聚合酶能顺利通过聚合酶能顺利通过O到达结构到达结构基因位置，进行转录，进而合成酶蛋白基因位置，进行转录，进而合成酶蛋白;当共阻遏当共阻遏物达到一定浓度时，阻遏蛋白与共阻遏物特异结物达到一定浓度时，阻遏蛋白与共阻遏物特异结合，使其结构改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因合，使其结构改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因亲和力增强，当阻遏蛋白结合到操纵基因上时，亲和力增强，当阻遏蛋白结合到

40、操纵基因上时，就阻止就阻止RNA聚合酶的通过，结果无法转录结构基聚合酶的通过，结果无法转录结构基因，使酶合成受阻。因，使酶合成受阻。 二二 打破酶合成调节机制的方法打破酶合成调节机制的方法 酶合成调节机制的意义在于：它能保证机体最经济、最有酶合成调节机制的意义在于：它能保证机体最经济、最有效地将体内的合成原料和能量用于合成生命最需要的物质。效地将体内的合成原料和能量用于合成生命最需要的物质。但是从应用的目的出发，如能设法打破这种机制，某些酶的但是从应用的目的出发，如能设法打破这种机制，某些酶的产量就可大幅提高，从已经报道过的试验数据来看，在采取产量就可大幅提高，从已经报道过的试验数据来看，在采

41、取相应的措施后，参与分解代谢的酶类产量，可能有上千倍的相应的措施后，参与分解代谢的酶类产量，可能有上千倍的变化，而参与合成代谢的酶类，则可有上百倍的变化，如何变化，而参与合成代谢的酶类，则可有上百倍的变化，如何打破这种机制？可从内外两方面进行考虑：打破这种机制？可从内外两方面进行考虑：（1）遗传控制）遗传控制：包括基因突变和基因重组。：包括基因突变和基因重组。（2）控制条件）控制条件：包括添加诱导物和降低阻遏物浓度。：包括添加诱导物和降低阻遏物浓度。（3）其他方法）其他方法：如添加表面活性剂，产酶促进剂等。：如添加表面活性剂，产酶促进剂等。（一）通过条件控制提高酶产量（一）通过条件控制提高酶产

42、量1.添加诱导物：添加诱导物：这一方法显然只适用于可诱导的酶类，但产生的效果十分这一方法显然只适用于可诱导的酶类，但产生的效果十分显著，关键是选择适宜的诱导物和诱导物浓度。显著，关键是选择适宜的诱导物和诱导物浓度。诱导物包括：诱导物包括：（1）酶的作用底物，但有些底物并不是诱导物。）酶的作用底物，但有些底物并不是诱导物。以前认为，诱导物应该是酶的底物，但事实上，底物不一以前认为，诱导物应该是酶的底物，但事实上，底物不一定都有诱导作用，相反不能作为底物的有时却能诱导酶的定都有诱导作用，相反不能作为底物的有时却能诱导酶的大量产生。现在的认识是：强有力的诱导物一般是一些难大量产生。现在的认识是：强有

43、力的诱导物一般是一些难以代谢的底物类似物。如异丙基以代谢的底物类似物。如异丙基D-巯基半乳糖不易被巯基半乳糖不易被酶作用，但是却是酶作用，但是却是半乳糖苷酶极好的诱导物，能使该酶半乳糖苷酶极好的诱导物，能使该酶的产量提高的产量提高1000倍，可达到细胞蛋白合成量的百分之几。倍，可达到细胞蛋白合成量的百分之几。（2）诱导物的前体）诱导物的前体如犬尿氨酸能诱导犬尿氨酸酶的合成，而它的前体如犬尿氨酸能诱导犬尿氨酸酶的合成，而它的前体Trp也有同也有同样效果。样效果。（3）胞外酶的作用产物）胞外酶的作用产物 如纤维素可诱导纤维素酶，但实际上真正起诱导作用的是如纤维素可诱导纤维素酶，但实际上真正起诱导作

44、用的是其产物纤维二糖。诱导和阻遏之间并没有绝对的界限。许多诱其产物纤维二糖。诱导和阻遏之间并没有绝对的界限。许多诱导物在某些情况下可表现诱导效应，而在另一些情况下却可能导物在某些情况下可表现诱导效应，而在另一些情况下却可能引起阻遏，关键在于浓度，即存在浓度效应，这种效应同样反引起阻遏，关键在于浓度，即存在浓度效应，这种效应同样反映在底物及其类似物上，当培养基中的映在底物及其类似物上，当培养基中的S很高，且易被分解时，很高，且易被分解时，往往会引起酶的分级代谢产物阻遏；反之如果将底物做成难以往往会引起酶的分级代谢产物阻遏；反之如果将底物做成难以代谢的衍生物时，或者当底物以十分缓慢的速度加入时，都

45、可代谢的衍生物时，或者当底物以十分缓慢的速度加入时，都可有效的诱导酶生成。有效的诱导酶生成。2降低阻遏物浓度降低阻遏物浓度阻遏可由分级代谢产物引起，也可由酶反应尾产物的积累引阻遏可由分级代谢产物引起，也可由酶反应尾产物的积累引起，因此，控制这两种产物都可能提高酶起，因此，控制这两种产物都可能提高酶 产量。一般原则是产量。一般原则是应避免采用过于丰富的培养基和避免采用易被利用的碳源，应避免采用过于丰富的培养基和避免采用易被利用的碳源，此外还应设法降低培养基中的有关效应物的浓度，并阻止这此外还应设法降低培养基中的有关效应物的浓度，并阻止这类效应物的形成。类效应物的形成。对于受分解代谢产物阻遏的酶来

46、说，通常采用直接限制碳源对于受分解代谢产物阻遏的酶来说，通常采用直接限制碳源或相应生长因子的供应。或相应生长因子的供应。对合成代谢的酶来说，有两种办法：一、在培养基中添加尾对合成代谢的酶来说，有两种办法：一、在培养基中添加尾产物类似物，或添加阻止尾产物形成的抑制剂，如加入产物类似物，或添加阻止尾产物形成的抑制剂，如加入噻唑丙氨酸可使参与组氨酸合成的噻唑丙氨酸可使参与组氨酸合成的10种酶的产量提高种酶的产量提高30倍。倍。二、采用营养缺陷型菌株，并限制其生长必须因子的供应，二、采用营养缺陷型菌株，并限制其生长必须因子的供应，如限制如限制His的营养缺陷型菌株的营养缺陷型菌株His的供应，可使与的

47、供应，可使与His有关的有关的10种酶解除阻遏，产量提高种酶解除阻遏，产量提高25倍左右。倍左右。（二）通过基因突变提高酶产量（二）通过基因突变提高酶产量 基因突变可发生在结构基因上，也可发生在操纵子其他基因突变可发生在结构基因上，也可发生在操纵子其他基因上，前一种情况将引起酶的结构改变和酶活性变化或基因上，前一种情况将引起酶的结构改变和酶活性变化或丧失，而后一种情况则影响到酶产量，根据酶合成调节机丧失，而后一种情况则影响到酶产量，根据酶合成调节机制，要使酶产量在基因突变后升高，不外乎两种可能：制，要使酶产量在基因突变后升高，不外乎两种可能：一一是使诱导型变为组成型是使诱导型变为组成型，即获得

48、的突变株在无诱导物存在，即获得的突变株在无诱导物存在的条件下，酶产量也能的条件下，酶产量也能 达到诱导的水平，这种突变又叫作达到诱导的水平，这种突变又叫作组成型突变。组成型突变。二二是使阻遏型变为去阻遏型是使阻遏型变为去阻遏型，即获得的突变，即获得的突变株在通常引起阻遏的条件下，酶产量也能达到无阻遏的水株在通常引起阻遏的条件下，酶产量也能达到无阻遏的水平。平。 基因突变可自发的产生，但几率非常小。基因突变可自发的产生，但几率非常小。物理方法：物理方法：如紫外线、如紫外线、射线（射线（60Co)及快中子照射能引及快中子照射能引起起DNA分子中四种脱氧核苷酸特别是分子中四种脱氧核苷酸特别是CT发生

49、过氧化反应，发生过氧化反应，造成造成DNA损伤或畸变。损伤或畸变。化学法化学法：（1）5溴尿嘧啶掺入溴尿嘧啶掺入DNA引起突变。引起突变。 （2）亚硝酸等通过和）亚硝酸等通过和DNA中的中的A,C,G等直接起化等直接起化 学反应而导致突变学反应而导致突变 （3）丫啶黄染料通过插入或缺失一个核苷酸而）丫啶黄染料通过插入或缺失一个核苷酸而造成移码突变。造成移码突变。在生产中用的较多的是紫外线照射，亚硝基呱处理，经常在生产中用的较多的是紫外线照射，亚硝基呱处理，经常替换使用不同的手段比连续使用同一手段要好。替换使用不同的手段比连续使用同一手段要好。诱变诱变是使微生物获得新性状的一种有力手段，但一个十

50、分是使微生物获得新性状的一种有力手段，但一个十分重要的问题是，要建立有效的重要的问题是，要建立有效的筛选筛选方法，将有前途的菌株方法，将有前途的菌株有效地筛选出来。有效地筛选出来。1.组成型变异株筛选组成型变异株筛选方法方法1：将诱变后的产酶菌株在以低诱导力的诱导：将诱变后的产酶菌株在以低诱导力的诱导物为主要碳源或氮源的培养基上培养，同时限制这物为主要碳源或氮源的培养基上培养，同时限制这种诱导物的量处于适当水平或同时加入诱导抑制剂，种诱导物的量处于适当水平或同时加入诱导抑制剂，在此条件下增值的为组成突变株。在此条件下增值的为组成突变株。 如将诱导后的大肠杆菌在恒定的低乳糖培养如将诱导后的大肠杆

51、菌在恒定的低乳糖培养基中培养，结果筛选出不需要诱导物的产基中培养，结果筛选出不需要诱导物的产半乳半乳糖苷酶的组成型突变株。其中该酶的产量可达细胞糖苷酶的组成型突变株。其中该酶的产量可达细胞内合成总蛋白的内合成总蛋白的25 方法方法2：将诱变后的产酶菌在含有和不含有诱导：将诱变后的产酶菌在含有和不含有诱导物的培养基上交替培养。如第一个周期使用葡萄糖物的培养基上交替培养。如第一个周期使用葡萄糖培养基这时只有少量组成型变异株，占优势的是诱培养基这时只有少量组成型变异株，占优势的是诱导型亲株，然后再转到乳糖培养基上，此时，对组导型亲株，然后再转到乳糖培养基上，此时，对组成型突变株的生长有利，而诱导型则

52、需要诱导生长成型突变株的生长有利，而诱导型则需要诱导生长时间，重复这种交替培养，就可提高组成型变异株时间，重复这种交替培养，就可提高组成型变异株的相对数目，并使其最终获得优势。的相对数目，并使其最终获得优势。2.抗分解代谢产物阻遏型变异株筛选抗分解代谢产物阻遏型变异株筛选对酶制剂工业来说，在很多情况下，要得到一种不对酶制剂工业来说，在很多情况下，要得到一种不引起分解代谢产物阻遏，而又经济的碳源，往往有引起分解代谢产物阻遏，而又经济的碳源，往往有很大困难，因此如果能够得到一种抗分解代谢产物很大困难，因此如果能够得到一种抗分解代谢产物阻遏的变异株，无疑将有很大意义，方法就是：阻遏的变异株，无疑将有

53、很大意义，方法就是：（1）以被阻遏的酶的底物为唯一碳源）以被阻遏的酶的底物为唯一碳源（2）变异后的产酶菌，在含有葡萄糖和不含葡萄糖）变异后的产酶菌，在含有葡萄糖和不含葡萄糖的培养基上交替培养。的培养基上交替培养。（三）其他提高酶产量的方法（三）其他提高酶产量的方法1.添加表面活性剂添加表面活性剂 很早就观察到，一定浓度的表面活性剂对某些细菌的生长有很早就观察到，一定浓度的表面活性剂对某些细菌的生长有促进作用，以后又发现，许多表面活性剂也能提高酶产量，特促进作用，以后又发现，许多表面活性剂也能提高酶产量，特别是有利于霉菌胞外酶的生产，且对菌体和酶没有太大的专一别是有利于霉菌胞外酶的生产，且对菌体

54、和酶没有太大的专一性。如当培养基中加入性。如当培养基中加入0.1Tween80时，就能使木霉菌的纤维时，就能使木霉菌的纤维素酶产量提高素酶产量提高20倍，使蔗糖酶产量提高倍，使蔗糖酶产量提高16倍。倍。通常采用的多是非离子型表面活性剂，如通常采用的多是非离子型表面活性剂，如Tween80、TritonX-100。他们对微生物无毒性或毒性很小。他们对微生物无毒性或毒性很小。 应用表面活性剂时，浓度非常重要，一般都有一个极限的最应用表面活性剂时，浓度非常重要，一般都有一个极限的最高浓度，在这个范围之内，随浓度增加酶产量也增加。高浓度，在这个范围之内，随浓度增加酶产量也增加。 目前认为，表面活性剂提

55、高酶产量特别是胞外酶，目前认为，表面活性剂提高酶产量特别是胞外酶，原因是他们能增大细胞膜的原因是他们能增大细胞膜的 通透性，通透性，在正常情况下，在正常情况下，不同菌的细胞膜的通透性是不同的，因此释放酶的能不同菌的细胞膜的通透性是不同的，因此释放酶的能力也不同，提高了通透性后，有助于打破细胞内酶合力也不同，提高了通透性后，有助于打破细胞内酶合成的成的“反馈平衡反馈平衡”，但也有一些事实难以解释，如许，但也有一些事实难以解释，如许多表面活性剂都有提高细胞通透性的能力，但在提高多表面活性剂都有提高细胞通透性的能力，但在提高酶产量上，发挥的作用却明显不同，没有平行关系。酶产量上，发挥的作用却明显不同

56、，没有平行关系。2.其他产酶促进剂（略）其他产酶促进剂（略）第四节第四节 动植物细胞培养生产酶动植物细胞培养生产酶和有用次生代谢产物和有用次生代谢产物 植物与人的关系是不言而喻的，但是从天然植物中提植物与人的关系是不言而喻的，但是从天然植物中提取次生代谢物还是受到了巨大挑战，原因是取次生代谢物还是受到了巨大挑战，原因是1.产量低，不能满足要求产量低，不能满足要求2.许多植物正趋于濒危灭绝许多植物正趋于濒危灭绝3.引种驯化困难引种驯化困难4.受自然环境及耕地影响较大受自然环境及耕地影响较大一一 动植物细胞的特点动植物细胞的特点（一）动植物细胞的特点和特性（一）动植物细胞的特点和特性（P51表表3

57、8）1.比微生物细胞大的多比微生物细胞大的多2.对剪切力敏感对剪切力敏感3.生长速率与代谢率低，倍增时间和发酵周期长生长速率与代谢率低，倍增时间和发酵周期长4.营养要求复杂，要求有血清或代用品营养要求复杂，要求有血清或代用品5.发酵产物不同发酵产物不同（二）植物细胞发酵特点（二）植物细胞发酵特点1.次生物质的生产是在可控制的条件下进行的，可通次生物质的生产是在可控制的条件下进行的，可通过控制发酵条件和筛选细胞系来提高次生物的产率，过控制发酵条件和筛选细胞系来提高次生物的产率，2.可排除病菌和虫害的影响及环境中有害物质的污染，可排除病菌和虫害的影响及环境中有害物质的污染，提高产品质量。提高产品质

58、量。3.倍增时间为倍增时间为1260小时，发酵周期为小时，发酵周期为1030天，与天，与植物生长周期相比大大缩短了生长周期。植物生长周期相比大大缩短了生长周期。4.可进行特定的生物转化反应以及探索新的合成路线。可进行特定的生物转化反应以及探索新的合成路线。二二 植物细胞的培养植物细胞的培养（一）高产细胞系的选择（一）高产细胞系的选择选择途径包括选择途径包括1.材料选择也即选择何种植物细胞材料选择也即选择何种植物细胞2.克隆选择克隆选择3.抗性选择抗性选择4.诱导选择诱导选择5.细胞融合与基因工程选择细胞融合与基因工程选择筛选方法（略）筛选方法（略）（二）影响产物产量的因素（二）影响产物产量的因

59、素1.材料来源材料来源2.培养基组分培养基组分碳源、氮源、维生素、无机盐和激素等碳源、氮源、维生素、无机盐和激素等3. 光照和温度光照和温度4.其他因素其他因素pH3提高植物细胞产量的途径提高植物细胞产量的途径四四 植物细胞植物细胞 培养系统培养系统（一）悬浮细胞培养（一）悬浮细胞培养悬浮培养悬浮培养是指将游离的植物细胞，按照一定的细是指将游离的植物细胞，按照一定的细胞密度，悬浮在液体中进行培养的一种方式。胞密度，悬浮在液体中进行培养的一种方式。固体培养基上可保存愈伤，用液体培养基可大量固体培养基上可保存愈伤，用液体培养基可大量繁殖细胞，生产有用物质。繁殖细胞，生产有用物质。 能大量提供均匀的

60、植物细胞，也就是同能大量提供均匀的植物细胞，也就是同步分裂的细胞步分裂的细胞 细胞增殖速度快，适用于大规模工业化细胞增殖速度快，适用于大规模工业化生产生产 需要特殊的设备，如大型摇床、转床、需要特殊的设备，如大型摇床、转床、连续培养装置，成本较高。连续培养装置，成本较高。悬浮培养的特点悬浮培养的特点1979年年 Brodelius 首次报道固定化细胞培养首次报道固定化细胞培养技术。技术。1984年年 Lindsey等将辣椒培养细胞装入聚等将辣椒培养细胞装入聚氨基乙酯泡沫中进行固定，可较长时间氨基乙酯泡沫中进行固定，可较长时间培养，形成比悬浮培养细胞多达培养，形成比悬浮培养细胞多达1000倍倍的