现代生化技术复习要点

1、第一章 重组DNA技术1. 寄主的限制和修饰现象： 细菌能将外来的 DNA片段某些专一位点上切断，从而保证其不 为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体 DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这 种现象叫做主的限制和修饰现象2.1限制性核酸内切酶H类酶特点：识别位点严格专一，并在识别位点内将DNA链切断2.2 n类限制性核酸内切酶命名：属名一个字母（大写）+种名两个字母（小写）+株名等+发现顺序（罗马字母）2.3限制性核酸内切酶的星号活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些限制性核酸内切酶的切割序列发生低特异性，这种性质称为限制性核酸内切酶的星号活性（限制性内切酶在含

2、 50%甘油的缓冲液中，于-20C稳定保存）2.4部分酶切：部分酶切是指，只对片段上一部分酶切位点产生切割。这种一般是在建库， 或者需要酶切基因组后， 获得一定大小范围内的片段而使用的酶切方法。这种酶切不要求获得某一大小的片段，而是要获得例如200-500bp的片段，在电泳上没有条带，而是smear。所以部分酶切需要严格控制酶的用量和时间，要尝试稀释后的酶液，切一定时间段内，哪一个条件可以获得目标范围的片段。部分酶切的条件需要更多的摸索，而且重复性要求也会更高。2.5同尾酶：识别位点不同但切出的 DNA片段具有相同的末端序列2.6同裂酶：来源不同，识别序列相同，切割位点可以相同（同序同切酶）也

3、可以不同（同 序异切酶），存在位点偏爱现象。3.1甲基化酶：许多n类限制性核酸内切酶都相应存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制 性核酸内切酶识别序列中某位碱基甲基化，从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割。用途：就是在必要时可以封闭某一限制性核算内切酶的切口。命名：在对应的限制性内切酶名字前面加M甲基化对限制性核算内切酶的影响：1.修饰酶切位点 2.产生新的酶切位点3.2 T4-DNA连接酶：在实验中绝大多数情况下使用的是T4-DNA连接酶，具有粘性末端和平末端。目前商品化的 T4-DNA连接酶是由大肠杆菌基因工程菌生产DNA连接酶：借助ATP或NAD水解提供的能量催化 DNA中相邻的3

4、' -OH和5' -P之间形成 的磷酸二酯键3.3 S1核酸酶：来源于米曲霉菌，其特征如下：1降解单链DNA or RNA,降解DNA的速度大于降解 RNA的速度2降解发生的方式为内切和外切，产生带5 '磷酸的单核苷酸或寡核苷酸3. 酶切活性需要的酸性环境，且为 Zn2+所激活4. 酶量小时仅切割带缺口或缺刻的双链DNA5. 酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性比单链低7.5万倍S1核酸酶常用来切平突出的单恋末端3.4 DNA聚合酶I :5'-3'聚合酶活性一聚合作用3'-5'外切酶活性一校对作用5'-3'外切酶活性

5、一切除修复作用（切口平移）Klenow酶：是大肠杆菌DNA聚合酶I的氨基大片段，没有5' -3'外切酶活性，基因工程中常用该酶填平5 '突出的粘性末端3.5末端脱氢核苷酸转移酶（TdT）:不需要模版只需要带 3 '羟基末端引物的 DNA聚合酶, 在二价阳离子的作用下，催化DNA的聚合作用，产生同源 3 '末端3.6碱性磷酸单酯酶：能将DNA RNA链及核苷酸的5 '端磷酸基团切除。4.1载体：指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具，载体同外源DNA在体外重组成 DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独立进行自我复制的遗传因

6、子4.2载体应具备的条件：1. 具有独立复制的能力，有复制起点2. 具有合适的限制性内切酶位点3. 具有合适的选择标记基因，用来筛选重组体DNA4. 能接纳尽可能大的外源DNA片段，具有较高的外源 DNA的装载能力4.3拷贝数：一种质粒在一个细胞中存在的数目4.4多克隆位点：许多限制酶的切点5. 质粒的基本特征：自主复制性、可扩增性、不相容性、可转移性、携带标记基因严紧型复制：除了受本身的复制机制的控制外，还受染色体的严紧控制。质粒的复制是同宿主细胞的复制偶联同步的在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝松弛型复制：只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的约束宿主细胞不合成蛋

7、白质时，松弛型质粒仍继续进行复制，每个宿主细胞中通常具有较高的 拷贝数（10个以上）在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素处理抑制蛋白质的合成 不相容性：两种质粒不能共存于同一受体细胞内6.1入DNA载体及类型载体的构建：缩短长度-删除重复的酶切口-加装选择标记-构建琥珀型密码子的突变体 载体类型：插入型&取代型6.2入DNA包装和限制包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，因此cos区对包装至关重要包装时由一个蛋白因子将 cos区交错切开，从而保证只有一个 DNA线状分子被包装在一个 噬菌体内，每个宿主细胞可包装多达100个成熟的入DNA分

8、子包装对 DNA本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装入DNA分子的75%-105% 入DNA全长48.5kb，也就是说可以包装 36.4kb-50.9kb 范围内的 DNA包装好了的入DNA便形成具有感染力的成熟的噬菌体颗粒7. 考斯质粒及其特点含有入DNA两端cos区的质粒由于入DNA在包装时，其包装蛋白只识别其粘性末端附近的一小段序列（cos区）将这一小片段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片段（45.9kb ）,同时它仍可像入DNA一样在体外被包装成具有感染活性的噬菌体颗粒，并高效 感染大肠杆菌不能在体内被包装，更不能裂解细胞，其制备与质粒相同进入

9、细胞后，完全依靠质粒上的复制子进行复制-携带质粒的选择标记，便于筛选 含有多种单一酶切位点，便于克隆8. DNA片段的连接定向克隆；外源 DNA片段定向插入载体分子粘性末端：（不同粘性末端的连接）1. 突出末端相同（5'突出）：用Klenow酶补平或S1核酸酶切平，之后再用T4DNA 连接酶连接2. 突出末端相同（3'突出）：用T4DNA聚合酶切平，之后再用 T4DNA连接酶连 接。3. 突出末端不同：用 Klenow酶补平或S1核酸酶切平，之后再用 T4DNA连接酶 连接平末端：属于分子内的连接，反应速度要比粘性末端的连接慢得多添加同聚尾末端方向：用Klenow补平或者用同聚

10、结尾法都是从5' -3'，切5'突出用S1核酸酶，切3'突出用T4DNA聚合酶9. 提高重组率的方法：（1 ）提高外源DNA片段与载体的分子比（2）载体分子在连接前先除磷（3 ）用TdT加装人工粘性末端10.1转化子：将质粒为载体构建的重组DNA导入受体细胞的过程称为转化。转化后的受体菌，称转化子10.2重组子：含有重组DNA分子的转化细胞10.3转化率：产生菌落的总数/DNA的加入量。定义：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数11.感受态细胞：受体细胞处于摄入外源 DNA的状态12.1转化：将质粒为载体构建的重组DNA导入受体细胞的过程12.2

11、转染：将噬菌体（病毒） DNA导入受体细胞的过程12.3转导：以噬菌体颗粒为媒介转移DNA的过程13.1抗菌性筛选法（ex环丝氨酸筛选）最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨苄青霉素（Ampr）、抗四环素（Tetr ）、抗卡那霉素（kanr ）等当培养基中含有抗生素是，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失13.2显色模型筛选法（蓝白斑实验）物体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选可以区分转化子和非转化子，也可区分重组子和非重组子14目的基因获取方法： 基因组

12、文库、CDNA文库、人工合成、PCRT增提取等15.1基因组文库：从生物组织细胞提取出全部DNA将DNA降降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞， 这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组 DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因 组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库15.2 cDNA文库：提取出组织细胞的全部 mRNA在体外反转录成 cDNA与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA!息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库具有组织

13、细胞特异性15.3 cDNA合成(第二链的合成)：(1)自身引导法：由于尚不完全清楚的原因，单链cDNA的3'端会自发形成发卡结构。此法所得的cDNA在其5 '端有几对碱基的缺失(2 )置换合成法：该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性，而是在dNTP存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系 列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成第二链。此法所得的cDNA在其5 '端也有几对碱基缺失。(3)引导合成法：首先制备一端带有Poly (dG)的片段 n和带有Poly (dT

14、)的载体片段I,并用片段I来代替 Oligo (dT)进行cDNA第一链的合成，在第一链 cDNA合成后直 接采用末端转移酶(TdT)在第一链cDNA的3'-端加上一段Poly (dC)的尾巴，同时进行 酶切创造出另一端的粘端，与片段n 一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在RNA酶H、大肠杆菌DNA聚合酶I和DNA连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链cDNA。此法所得的cDNA保留了完整的5 '端序列。第二章PCR1. PCR反应体系主要由什么构成的？作用？PCR反应体系：核酸模版、引物、DNA聚合酶、dNTP Mg2+缓冲液核酸模版：可以以 DNA或 RNA为模版对靶序

15、列进行 PCR扩增引物：互补于单链 DNA片段的一小段寡核苷酸。PCR产物的特异性由一对上下游引物所决定 dNTP四种浓度应相同。dNTP能与Mg2+吉合，使游离的 Mg2+浓度降低TaqDNA聚合酶：可在高温下仍具有活性。TaqDNA聚合酶具有5' -3'外切酶活性，但不具有3' -5'外切酶活性，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。Taq聚合酶同时具有类似于末端转移酶的功能Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必须的，也影响着引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、 产物的特异性、引物二聚体的形成等缓冲液：有利于引物退火2. PCR产物的特点：3 

16、9;都有一个 A突出2. PCR技术的特点：RNA或 cDNA对起始材料质量要求低、应用敏感性高、特异性强、操作简便快速、可扩增 范围广3. 设计PCR引物时一般要注意哪几个方面：(3' 比 5'重要)引物长度：不宜太长或太短引物扩增跨度：以 200-500bp为宜引物碱基 G+C含量：以40%-60为宜碱基分布：最好随机分布，避免嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列引物自身和引物之间不应存在互补序列：避免引物内部出现二级结构引物3'端的碱基：特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基 不配对而导致PCR失败引物的5'端不严格，可以修饰引物的特异性：引物

17、应与核苷酸序列数据库的其他序列无明显同源性引物量应适中，过高引起错配和非特异性扩增；过低引起产物量降低4. PCR循环温度参数的含义及设定PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤组成的。如某设定的反应参数是 94C变性一分钟，60C退火（低于扩增引物在 PCR条件下真是Tm值5C） 1min , 72C延伸 1.5min。第三章原材料的选择和处理1. 原材料预处理的目的：防止有效成分降解失活、后续操作的要求、便于储存和运输2.1发酵液预处理的目的： 改变发酵液的物理性质，以利于固液分离 去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作2.2发酵液预处理的主要方法：凝聚

18、和絮凝、稀释、加热、调ph、加沉淀剂等凝聚：在电解质作用下，发酵液中的胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小的凝聚体的过程,由于双电层排斥电位的降低，胶体表面水化层破坏或变薄，而使胶体体系不稳定的现象絮凝：在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是种以物理的集合为主的过程3 细胞破碎有哪些方法？基本原理机械法：高压匀浆法：利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于突然减压和高速撞击使细胞破裂高速珠磨法：进入珠磨机的细胞悬液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物 超声波破碎法：由于超声波的

19、 空穴作用（在超声波作用下，气泡形成、长大和破碎，在气泡 破碎期间，大量声能转化成机械能，引起局部的剪切使细胞破碎）引起的冲击力和剪切力使 细胞破碎组织捣碎法：使用高速组织捣碎机，是一种激烈的破碎器。这种绞切力对动植物组织有效 研磨法：可以利用研钵和研杵进行研磨非机械法：化学法：化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成 有机溶剂：用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯等）处理细胞时，可把细胞壁、细胞膜 的结构部分溶解，使细胞结构破坏，而将胞内物质释放出来 表面活性剂：表面活性剂是两性化合物，分子中有一个亲水基团和一个疏水基团，在适当的ph值和离子强度下，它们凝聚在一起形成微胶束，疏水

20、基团聚集在胶束内部将溶解的脂蛋白包在中心，而亲水集团则向外层，这样使膜或壁的通透性改变或使之溶解，表面活性剂 方法特别适合于膜结合蛋白酶的溶解物理法：主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法 渗透法：将细胞放在高渗透压的介质中，达平衡后，转入到低渗透压的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞快速膨胀而破碎，使细胞内容物释放 到溶液中 反复冻融法：将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水形成的冰晶粒，使细胞内外溶液浓度发生变化，引起细胞膨胀而破裂酶溶法：利用酶反应，

21、分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的4. 蛋白质和酶水溶液提取影响因素：离子强度：低离子强度溶液除了增加许多生化物质的溶解度外，还对一些物质生理活性有稳定作用，所以稀盐溶液常用于大多数生化物质的提取（盐溶和盐析现象）PH值：一般选择的ph值应在偏离被提取的蛋白质等电点的稳定区内。通常碱性蛋白质选择 偏酸的一侧，酸性蛋白质选在偏碱的一侧，以增大蛋白质的溶解度。尽量避免过酸，过碱， 一般控制在Ph6-8范围温度：蛋白质和酶一般都不耐热，提取时通常要求低温操作搅拌：搅拌能促使溶质与提取液的接触，并能增加溶解度，一般采用温和的搅拌方法，太快易产生泡沫是某些蛋白质和酶变性失活5.1包含体：很多利

22、用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约为0.1-1微米的固体颗粒包含体 （过度表达产生的）。包含体主要由蛋白质构成，其中大部分是基因表达产物5.2包含体提取的一般操作步骤和方法：收集细胞t裂解细胞t回收包含体t洗涤包含体t溶解包含体t蛋白质复性t蛋白质纯化 收集包含体：破碎含包含体的宿主细胞，通常使用机械破碎法，如高压均浆法、超声波破碎法、超声波 结合溶菌酶破碎法等。离心收集包含体。洗涤包含体：为了出去包含体上粘附的杂质，如膜蛋白、核酸、脂质等。洗涤剂通常是含去污剂 Triton X-100、脱氧胆酸盐、低浓度的变性剂尿素、盐酸胍等的

23、缓 冲液溶解包含体：一般采用强的变性剂：常用盐酸胍浓度5-6mol/L、尿素6-8mol/L。加入还原剂，打开错配的二硫键：二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、半胱氨酸等。加入金属螯合剂如 EDTA等，防止已处于还原状态的巯基与金属离子发生反应。蛋白质复性：通过稀释法把变性溶解的蛋白质直接加入到复性液中，通过透析或凝胶过滤 法完全去掉变性剂和还原剂。第四章萃取技术1.1分配定律：在一定温度，一定压力的条件下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中，达到 平衡时溶质在两相中的活度之比为一常数，如果是稀溶液，活度可以用浓度代替1.2分配系数：分配定律中的常数被称为分配系数K= 萃取相浓度/萃余项浓度。K越大，则在萃

24、取相中溶质的溶解度越大1.3分离因素3 :表示目的产物与杂质的分离效果，可用分离因素表示。3值定义为产物与杂质分配系数之比。分离因素体现了不同溶质分配系数的差异，是实现萃取分离的基础， 决定了两种溶质是否能分离2. 溶剂萃取的影响因素：pH值：水相ph值影响弱电解质分配系数溶质在不同ph下有着不同的解离状态，在水中或有机溶剂中便有不同溶解度离子状态的物质易溶于水，非解离的分子状态易溶于有机溶剂酸性物质处于低 ph值，碱性物质处于高 ph值时为分子状态，转溶于有机溶剂 温度：温度印象溶质分配系数和萃取速度萃取操作一般在常温或较低温度下进行离子强度：无机盐的存在可降低溶质在水相中的溶解度，有利于溶

25、质向有机相中分配无机盐的加入还能减少有机溶剂在水相中的溶解度无机盐用量要适量，用量过多也有可能促使杂质一起转入溶剂相3.1双水相体系：将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值时， 体系会自然地分成互不相溶的两相，两相中均含有水分，构成双水相体系3.2双水相体系形成的原理由于高聚物之间的不相溶性：高聚物分子空间的阻碍作用，使其无法相互渗透， 不能形成均一相，从而产生相互分离的倾向。当两者浓度达到一定时即可分成两相某些聚合物溶液和一些无机盐溶液相混时，在一定浓度下，由于盐析作用，也会形成两相3.3相分离速度影响：相分离速度直接取决于相密度差，两相密度差越大，相分离速度越快靠近临

26、界点的相间密度差较小，因此相的分离速度较慢远离临界点的聚合物浓度高，聚合物富相的粘度会增加也会导致低的分离速度在中间组成时，分离速度最佳4.1超临界流体：液体和压力超过超临界温度和临界压力，介于气体和液体之间的液体。4.2超临界流体的特性：低粘度，高密度，扩散系数大等特性4.3超临界流体萃取：等温法：依靠压力变化的萃取分离方法在一定温度下，使超临界流体和溶质减压，经膨胀后分离，溶质由分离器下部取出， 气体经压缩机返回萃取器循环使用等压法：依靠温度变化的萃取分离法经加热、升温使气体和溶质分离， 从分离器下部取出萃取物，气体经冷却、压缩后返回萃 取器循环使用吸附法：用吸附剂进行的萃取分离法在分离器

27、中，经萃取出的溶质被吸附剂吸附，气体经压缩后返回萃取器循环使用第五章沉淀法1.1盐析原理：向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质的溶解度降低而从溶液中析出的现象称为盐析。溶液中的盐离子与蛋白质分子争夺水分子，减弱了蛋白质的水合程度（失去水化膜），暴露出疏水区域，使蛋白质的溶解度降低。盐离子所带电荷部分地中和蛋白质分子上的电荷，蛋白质表面的双电层厚度降低，使蛋白质分子之间静电排斥作用减弱，也促使蛋白质沉淀。1.2盐析公式和各参数的意义以及影响因素：盐析公式：lgS= 3 -KsIS为溶解度3为假设离子强度等于 0时蛋白质的溶解度的对数值，它可由直线延长与纵轴交点的截距

28、 求得。其不但与 蛋白质的性质和盐的种类 有关，而且还与 溶液的ph值和温度 有关，在高离 子强度的溶液中，温度升高一般使3值下降，即蛋白质的溶解度下降。Kb为盐析常数，它等于直线的斜率。它与溶液的ph和温度无关，只依赖于蛋白质的性质和盐的种类。I为离子强度 2.盐析方法：Ks盐析：固定蛋白质溶液的ph值和温度，改变盐的浓度（即离子强度）以达到沉淀的目的， 常用于蛋白质的粗品分级沉淀，如酶制剂的制备等3盐析：在一定的离子强度下， 改变溶液的ph值或温度以达到沉淀的目的。3盐析常用于蛋白质的进一步分离纯化，如蛋白质、酶在饱和硫酸铵溶液中保温结晶等3. 沉淀曲线及影响因素：沉淀曲线：在溶解度曲线中

29、，以曲线的斜率对硫酸铵溶液的饱和度作图，由于这种沉淀作用的起始很迅速，以后逐渐变慢，形成了一条前沿陡峭，后沿比较平坦的蛋白质沉淀的分布曲 线。影响因素：蛋白质沉淀分布曲线的峰宽，由盐析公式中的Ks决定，而峰在横轴上的位置是由3值和蛋白质的浓度决定的，所以说其不但与 蛋白质的性质和盐的种类 有关，而且还与溶液的ph值和温度有关。4.1常用盐的选用：硫酸铵是最普遍使用的盐析剂无机盐的挑选原则：较高的盐析效能高溶解度，能配制高离子强度的盐溶液溶解度受温度的影响小盐溶液的密度不高便于蛋白质沉淀和离心分离不易引起蛋白质的变性价格低廉4.2加入方式：加入固体盐法饱和溶液法：可加入预先配制好的硫酸铵饱和溶液

30、透析盐析：将蛋白质溶液盛于透析袋，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，使蛋白质溶液中盐浓度发生连续性的变化，也会产生蛋白质的沉淀作用反抽提法4.3盐析后脱盐方法： 渗透法/超滤法、凝胶过滤法5.1有机溶剂沉淀原理：有机溶剂的加入会使溶液的介电常数减小，导致溶剂的极性减小水溶液有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度有机溶剂可能破坏蛋白质的某些键如氢键等，使其空间结构发生某种变化， 致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀当蛋白质的空间结构发生变形超过一定程度时，便会导致完全的变性5.2影响因素：

31、温度：多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降 ph值：一般在等电点时，溶解度最低蛋白质浓度：样品较稀时，将增加溶剂投入量，降低了溶质收率，容易产生稀释变性，但 共沉作用小，浓的样品会增强共沉作用，降低分辨率，但减少了溶剂用量，提高了回收率， 且样品变性小于稀溶液离子强度：中性盐存在会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，溶液中含有适量的低的离子强度，对酶或蛋白质具有保护作用，可防止变性，但加入量太多，影响分级作用多价阳离子的影响6. 介电常数和溶剂极性的关系：介电常数越小，溶剂极性越小第六章膜分离1.1膜分离：利用具有一定选择透过特性的介质在推动力作用下进行物质的分离纯化1.2各

32、类膜分离技术的原理：以浓度差为推动力的过程A、渗透：当把溶液和溶剂分别置于此膜的两侧时，纯溶剂将自然穿过半透膜而自发地向溶 液（或从低浓度向高浓度）一侧流动B 透析：借助膜的扩散使各种溶质得以分离的过程，与渗透的区别：膜不同。以压力差为推动力的过程A、反渗透：在溶液的液面上施加一个大于渗透压的压力P时，溶剂将于原来的渗透方向相反，开始从溶液向溶剂一侧流动，这就是反渗透B 超滤：通过膜的筛分作用将溶液中大于膜孔的大分子溶质截留，使这些溶质与溶剂小分 子组成分离的膜过程C 纳滤：纳滤膜的孔径为纳米级，介于反渗透膜和超滤膜之间，能截留透过超滤膜的那部 分小分子量的有机物，透过被反渗透膜所截留的无机盐

33、D微孔过滤：利用膜的筛分性质，以压差为传递推动力进行分离的膜过程 以电场力为推动力的过程A、电渗析：在透析的基础上加上直流电，极大加快离子的透析速度。膜分离过程中，离子 在电势的驱动下，通过选择性渗透膜，从一种溶液向另一种溶液迁移2.1分离膜的形态结构一是分不分层及各层的厚度，二是每一层内孔的形态及多少。可分为对称膜（均质膜）和不对称膜（主要由起膜分离作用的表面活性层和起支撑强化作用的惰性层构成）2.2孔道结构：包括孔径、孔径分布和孔隙度孔径分布是指膜中一定大小的孔的体积占整个孔体积的百分数，孔隙度是指整个膜中孔所占的体积百分数，孔径分布窄的膜比孔径分布宽的膜要好3.1截留率：表征膜对溶质的截

34、留能力，如果膜能完全截留溶质，R=1,弱国溶质可自由透过，则R=03.2截留分子量：指能被膜截留住的最小溶质分子质量4.1膜污染：由于在膜表面上形成了附着层或膜孔堵塞等外部因素，导致膜性能变化，它不 仅使膜的透水率降低，而且使其截留分子变小4.2膜劣化：膜自身发生了不可逆转的变化等内部因素导致膜性能变化5.1浓差极化：在膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面上，不能完全透过膜的 溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高，这种在膜表面附近浓度高于主体浓度的现 象称为浓度极化或浓差极化5.2减小浓差极化的方法：采用切向流过滤法使被处理溶液平行于滤膜表面流动，与滤过方向垂直(相切)，溶液在压

35、力的作用下滤过，可有效地破坏浓差极化的形成条件采用湍流，可加快料液流速，大大减少浓差极化对透水率的影响降低料液粘度等第七章层析技术1.凝胶层析的原理：利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术2.1 Kd参数及大小的意义：分配系数Kd是衡量溶质被排阻程度的一个特征性常数：Kd=(Ve-Vo) /ViVe：洗脱体积Vo：外水体积Vi :内水体积Kd=0表示全排阻，Kd=1表示全通过，一般来说 0 < Kdw 12.2床体积、内水体积、外水体积、洗脱体积床体积Vt :凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积外水体积Vo：层析柱内凝胶颗粒之间的空隙内

36、水体积 Vi :凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这部分间隙的总和称为内水体积，不包含固体支持物体积Vg洗脱体积Ve：指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积3.1组别分离：如果实验目的是将样品中大分子物质和小分子物质分开，由于他们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离3.2分级分离：如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又 叫分级分离4.Sephadex G类凝胶及代号的意义葡聚糖凝胶的商品名为Sephadex,它是由葡聚糖加入交联剂环氧丙烷通过醚键相互交联聚合而成的，其网孔大小可通过调节交联剂和葡萄糖的比例以及反应条件来控制。不同规格型

37、号的葡聚糖用英文字母 G表示，后面的数字为凝胶吸水量的10倍，数字越大，孔径越大。5.1离子交换剂及类型离子交换剂通常由载体、电荷基团和反离子构成，通常是一种不溶性高分子化合物，有疏松的多孔结构或巨大的表面积，有较多的交换基团，有稳定的物化性质类型：阳离子交换剂：强酸型、弱酸型阳离子交换剂阴离子交换剂：强碱型、弱碱型阴离子交换剂正离子用阳离子交换剂分离，负离子用阴离子交换剂分离，酸性蛋白质用阴离子交换剂较好，碱性蛋白质用阳离子交换剂较好。5.2转型：离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程5.3再生：使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令其恢复原来的性状5.4交换容量：离子交换剂与溶液中离

38、子或离子化合物进行交换的能力6. 离子交换层析的原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。低离子强度有利于吸附，高离子强度有利于洗脱平衡：让缓冲液恒压流过层析床，流速可比操作时的流速略高。缓冲液的用量至少为床体积 的两倍，这样才能使层析床压实稳定，并使交联剂与缓冲液达到平衡洗脱：使起始条件下发生吸附的目的物从离子交换剂上解吸。可采用改变流动相的ph值或离子强度，改变离子强度是最常用的洗脱法。7. DEAE-Sephadex A-25、DEAE-Sepharose CL-6B （或

39、 CM类各符号的意义）CM-（羧甲基） DEAE-（二乙基氨基乙基）为功能基Sephadex为葡聚糖，Sepharose为琼脂糖CM纤维素为阳离子交换剂，DEAE纤维素为阴离子交换剂阴离子交换剂用英文字头 A,阳离子交换剂用英文字头C,英文字母后面的数字表示型号。Sepharose CL-6B中的数字代表凝胶中琼脂糖含量的百分数，数字越大孔径越小8. 亲和层析的基本原理可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其他没有亲和力的无关组分就随流动相流出，然后改变流动组成分，将结合的亲和物洗脱下来。9. 载体的排斥效应？空间障碍和解决方法载体的排斥效应：利用凝胶作亲和层析的载体时，孔径大小决定了配基与其亲和化合物相互 作用的可能性，如果将特异性配基固定在小孔径凝胶载体上，载体会明显地阻止大分子化合物与配基结合，从而影响亲和柱的吸附效率。载体的空间障碍：当配基固定在载体上后，载体往往产生对配基的空间障碍作用，影响了分离物与固定化配基的亲和效果，小分子配基尤其