第三章作物基因工程

1、第三章第三章 作物基因工程作物基因工程 第一节 基因工程与转基因作物 第二节 无标记转基因作物获得技术 第三节 转基因作物的遗传特性第一节 基因工程与转基因作物1.1 基因工程18651972 - Paul BergProduces first recombinant DNA using EcoRIEcoRI recognition sitesPlasmid DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky endSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant

2、 DNA18651973 - Boyer, Cohen & ChangTransform E. coli with recombinant plasmidStanley Cohen & Annie ChanHerbert BoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE. coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycl

3、ineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies载体结构的三大要素：载体结构的三大要素： 多克隆位点多克隆位点 选择标记（耐药性，选择标记（耐药性，LacZLacZ） 独立的复制单位独立的复制单位种类：种类： 质粒质粒 噬菌体噬菌体 酵母人工染色体（酵母人工染色体（YACYAC） 反转录病毒载体反转录病毒载体 表达载体表达载体1.2 转基因作物转基因的作用转基因作物在全球分布1996年至年至2008年全球转基因作物种植面积：工业化国家与发展中国家（单位：百万公顷）年全球转基因作物种植面积：工业化国家与发展中国家

4、（单位：百万公顷）资料来源：资料来源： Clive James，2008四大转基因作物种植面积得益于采用得益于采用复合性状复合性状并拓展具有农艺、并拓展具有农艺、优质优质及其他特性的作物，再加上及其他特性的作物，再加上约约3年后将年后将应用应用的耐旱特性的耐旱特性，美国、加拿大和澳大利亚的转基因作物会继，美国、加拿大和澳大利亚的转基因作物会继续保持增长续保持增长 。 高昂的高昂的农产品农产品价格会促进转基因作物的种植价格会促进转基因作物的种植第一个十年（第一个十年（1996年年-2005年）属于美洲年）属于美洲，在第二个十年中，以印度、中，在第二个十年中，以印度、中国和越南国和越南等新兴国家为

5、首的等新兴国家为首的亚洲很可能亚洲很可能出现强势增长出现强势增长 巴西巴西拥有巨大潜力，拥有巨大潜力，有可能引领拉美的增长有可能引领拉美的增长非洲非洲 种植转基因作物的国家数量会略有增长，其中以北非的种植转基因作物的国家数量会略有增长，其中以北非的埃及埃及、西、西非的非的布基纳法索布基纳法索和东非的和东非的肯尼亚肯尼亚为最为最 欧盟会保持缓慢到中度的增长步伐，欧盟会保持缓慢到中度的增长步伐，东欧东欧潜力巨大潜力巨大以以美国、巴西美国、巴西以及许多其他国家为首将以及许多其他国家为首将转基因作物用作转基因作物用作生物燃料生物燃料 乙醇和乙醇和生物柴油生物柴油 ，将成为一种，将成为一种重要的新发展重

6、要的新发展。 整理人：整理人： Clive James，2008第二节 无标记转基因作物获得技术PCR analysis for target gene第三节 转基因作物的遗传特性 3.1 外源DNA的整合特性 整合位点是随机的，但多发生在同源序列区和高度重复序列区。 农杆菌转化法整合外源基因拷贝数较少，往往是单拷贝；基因枪转化法整合外源基因拷贝数较多，往往多单拷贝；采用强启动子整合外源基因拷贝数较多。3.2 位点特异性重组 重组只发生在具有特定DNA序列的位置上，由特定的酶来识别该特定序列并产生作用，从而使DNA重组，也称定位重组。 目前发现的有4个定位重组系统： Cre/lox，FLP/F

7、RT，R/RS，Gin/gix定位重组系统重组系统Cre/loxFLP/FRTR/RSGin/gix来源噬菌体P1酿酒酵母2u质粒结合酵母pSR1噬菌体Mu天然功能整合进入宿主基因组，环化维持质粒高拷贝数维持质粒高拷贝数及反向重复序列的精确同源控制宿主范围的专一性重组酶Cre:38.5kDaFLP : 48kDaR : 56kDaGin :21.7kDa家族整合酶整合酶整合酶转化酶识别位点loxP: 34bp FRT: 34bp RS: 58bpgix: 34bp反向重复13bp13bp12bp12bp不对称间隔8bp8bp7bp2bp切割位点间隔区边缘 间隔区边缘 间隔区边缘 间隔区边缘Cr

8、e/lox定位重组系统的工作方式CreloxPloxPA：B：C：缺失倒位插入，即位点特异性重组+质粒质粒loxP基因座的序列和结构ATAACTTCGTATATATTGAAGCATATTATACGAAGTTATATATGCTTCAATAATGTATGCTACATACG3.3 外源基因的表达 3.3.1 瞬时表达 短时间内的外源基因表达。 瞬时表达是未整合的外源基因的表达，是一种正常的表达方式。 常被用来进行农杆菌转化能力的检测，基因表达调控研究，基因功能初步验证。3.3.2 稳定表达 1 组成型表达及其启动子 特点：上游存在6聚体花纹序列TGACTG，其往往以重复形式出现并被6-8bp隔开。 nos 和 ocs启动子(后者对禾本科无启动能力) 双向启动子：479bp CaMV 35S启动子2 组织特异性表达及启动子 马铃薯块茎蛋白基因启动子：只在块茎中表达，茎秆和根系偶尔表达，但不在叶片中表达。 小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子；番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子；花粉特异表达基因（lat52）启动子。3 诱导型表达及启动子 光诱导启动子：SSrbc和LHCPa/b 热诱导启动子：热激蛋白启动子 损