第六章 基因操作中大分子的分离和分析

1、第六章第六章 基因操作中大基因操作中大分子的分离和分析分子的分离和分析第一节第一节 DNADNA的分离、检测和纯化的分离、检测和纯化分离纯化核酸总的原则：分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 。无其他核酸分子的污染（如抽提无其他核酸分子的污染（如抽提DNADNA分子时应去除分子时应去除RNARNA分子）。分子）。分离核酸应注意以下几点：分离核酸应注意以下几点：减少化学因素对核

2、酸的降解：酸、碱减少化学因素对核酸的降解：酸、碱减少物理因素对核酸的降解：机械力减少物理因素对核酸的降解：机械力防止核酸的生物降解：进行核酸分离时最好新防止核酸的生物降解：进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或应将材料贮存于液氮中或-70-70冰箱中。冰箱中。1.1 DNA提取的步骤提取的步骤一、细胞破碎一、细胞破碎二、除去与核酸结合的蛋白质等杂质二、除去与核酸结合的蛋白质等杂质三、除去其他杂质核酸三、除去其他杂质核酸四、获得四、获得DNA样品样品一、细胞破碎一、细胞破碎 目前细胞破碎主要有目前细胞破碎主要

3、有物理破碎物理破碎（主要是机（主要是机械破碎）和械破碎）和非物理破碎非物理破碎（主要化学破碎和生物（主要化学破碎和生物酶解）酶解） （一）、物理破碎（一）、物理破碎 目前目前常用物理破碎的方法常用物理破碎的方法主要有：主要有：均质珠子研磨均质珠子研磨振荡振荡、液氮研磨液氮研磨、乳钵研磨乳钵研磨、冻融冻融、煮沸煮沸、超声波超声波(ultrasonication(ultrasonication) )和和微波加热微波加热(microwave heating)(microwave heating)等。等。1 1、微波加热微波加热对于革兰氏阳性细菌非常有效，但是加热对于革兰氏阳性细菌非常有效，但是加热必

4、须适中，否则必须适中，否则DNADNA可能被破坏。可能被破坏。 2 2、热激处理热激处理包含包含冷冻冷冻和和融解融解两步，两步，冷冻冷冻主要是用液氮、主要是用液氮、冰箱冰箱( (7070、20)20)或冰，而或冰，而融解融解主要是主要是3737、5050、65 65 或或100100水浴，其中冻融循环次数和孵育水浴，其中冻融循环次数和孵育时间可以根据不同要求变化。时间可以根据不同要求变化。 如，如，Lee(1996)Lee(1996)等通过用吖啶橙染色直接统计经三次等通过用吖啶橙染色直接统计经三次热激热激 ( (70/65)70/65)联合溶菌酶和联合溶菌酶和SDSSDS处理后的细胞裂处理后的

5、细胞裂解率为解率为90%90%。 热激处理比其他物理处理的剪切力要小很多，而且提热激处理比其他物理处理的剪切力要小很多，而且提取效率、得到片段完整性较好。取效率、得到片段完整性较好。3 3、珠子打击法珠子打击法(bead beating) (bead beating) 加入不同直径的玻璃珠，有利于不同细胞加入不同直径的玻璃珠，有利于不同细胞DNADNA的提取：的提取： 直径为直径为710 710 1180 m1180 m 玻璃珠可打碎土壤块和植玻璃珠可打碎土壤块和植物细胞；物细胞； 425 425600 m600 m 玻璃珠可打碎真菌、植物和其他真玻璃珠可打碎真菌、植物和其他真核细胞；核细胞；

6、 106 m 106 m 玻璃珠可打碎细菌细胞。玻璃珠可打碎细菌细胞。在使用玻璃珠研磨法时，应在珠子大小和数量上具有在使用玻璃珠研磨法时，应在珠子大小和数量上具有合适的配比，这样才能有效地破碎和抽提微生物的营合适的配比，这样才能有效地破碎和抽提微生物的营养细胞、内生孢子或分生孢子的养细胞、内生孢子或分生孢子的DNADNA。珠子打击法优点：珠子打击法优点：有有更好的裂解效率和产量更好的裂解效率和产量，而且其，而且其DNADNA产量随着打击时间和打击速度的增加而增加，因产量随着打击时间和打击速度的增加而增加，因此，可以用较小的抽提缓冲液体积处理较小的样品得此，可以用较小的抽提缓冲液体积处理较小的样

7、品得到满意的获得率。到满意的获得率。珠子打击法缺点：珠子打击法缺点：随着打击处理而增加产量的同时，随着打击处理而增加产量的同时，剪切力增大并导致小片段增加剪切力增大并导致小片段增加，从而影响，从而影响PCRPCR的敏感的敏感性，甚至可能增加嵌合体形成率而影响随后的分子生性，甚至可能增加嵌合体形成率而影响随后的分子生物学处理及结果，特别是引起多样性分析的偏差。物学处理及结果，特别是引起多样性分析的偏差。（二）非物理破碎法（二）非物理破碎法 非物理破碎法相对比较温和，利于保持非物理破碎法相对比较温和，利于保持DNADNA的完整性。其主要是包括的完整性。其主要是包括化学破碎化学破碎和和生物生物酶解酶

8、解。1、化学破碎、化学破碎 目前化学破碎法常用的化学试剂主要是阴目前化学破碎法常用的化学试剂主要是阴离子型去污剂离子型去污剂SDSSDS（十二烷基硫酸钠）、（十二烷基硫酸钠）、SarkosylSarkosyl（N-N-十二烷基肌氨酸钠）和阳离子型十二烷基肌氨酸钠）和阳离子型去污剂去污剂CTABCTAB（十六烷基三乙基溴化铵）等。（十六烷基三乙基溴化铵）等。 2、生物酶解、生物酶解在生物酶解中最普遍使用的是在生物酶解中最普遍使用的是溶菌酶溶菌酶，其主要是通过水解，其主要是通过水解细胞壁而达到裂解细胞的目的，特别是对革兰氏阳性菌的细胞壁而达到裂解细胞的目的，特别是对革兰氏阳性菌的破碎，同时溶菌酶还

9、可以水解糖苷键和腐殖酸的化合键从破碎，同时溶菌酶还可以水解糖苷键和腐殖酸的化合键从而改善而改善DNADNA纯度。纯度。由于生物酶解比较温和，故其常常还需要跟化学、物理等由于生物酶解比较温和，故其常常还需要跟化学、物理等裂解方法联合使用。裂解方法联合使用。目前除了使用溶菌酶外，也有添加旨在提高革兰氏阳性菌目前除了使用溶菌酶外，也有添加旨在提高革兰氏阳性菌裂解的裂解的消色肽酶消色肽酶(achromopeptidase(achromopeptidase) )、消化蛋白的蛋白酶消化蛋白的蛋白酶K(proteinaseK(proteinase K) K)( (主要通过酶解膜蛋白来提高裂解细胞以主要通过酶

10、解膜蛋白来提高裂解细胞以及消化蛋白而有利于随后的核酸分离纯化及消化蛋白而有利于随后的核酸分离纯化) )以及在富含有以及在富含有机酸的样品中有利于核酸释放的机酸的样品中有利于核酸释放的链霉蛋白酶链霉蛋白酶(pronase(pronase) )等。等。n一般来说，单独使用一种处理方法效果都不会一般来说，单独使用一种处理方法效果都不会很好，而适当的组合可产生很好的效果。很好，而适当的组合可产生很好的效果。二、除去与核酸结合的蛋白质等杂质二、除去与核酸结合的蛋白质等杂质苯酚苯酚对蛋白质有极强的变性作用，而对对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响；无影响；氯仿氯仿也可使蛋白质变性，对也可使蛋白质变性

11、，对DNA无影响；无影响；蛋白酶蛋白酶可降解蛋白质，故在实验中也常使用。可降解蛋白质，故在实验中也常使用。注：苯酚的残留会严重干扰后续的分子操作，故用苯酚去除蛋白质后注：苯酚的残留会严重干扰后续的分子操作，故用苯酚去除蛋白质后还需用氯仿还需用氯仿/异戊醇（异戊醇（24:1）抽提两次，以去除残留的蛋白质和苯）抽提两次，以去除残留的蛋白质和苯酚。酚。三、除去其他杂质核酸三、除去其他杂质核酸 在在DNADNA提取中会有少量的提取中会有少量的RNARNA杂质残留，但杂质残留，但RNARNA极易降解，一般情况下对后续的极易降解，一般情况下对后续的DNADNA操作无操作无大影响。如要求大影响。如要求DNA

12、DNA纯度较高时可加入纯度较高时可加入RNARNA酶酶（RNaseRNase）以降解）以降解RNARNA。四、获得四、获得DNA样品样品含含DNA的水相可用以下几种沉淀剂沉淀：的水相可用以下几种沉淀剂沉淀：a. 无水乙醇无水乙醇（最常用）：易于从（最常用）：易于从DNA沉淀中除去。但所需的沉淀中除去。但所需的体积大（体积大（2倍），由于使用的管多为倍），由于使用的管多为 一次性，比较浪费。一次性，比较浪费。b. 异丙醇异丙醇：能与自由水紧密结合。结合了溶解：能与自由水紧密结合。结合了溶解DNA的水分子，的水分子，使使 DNA沉淀。可常温沉淀，离心，加入体积为沉淀。可常温沉淀，离心，加入体积为0

13、.61倍体倍体积，但不易除去，需用积，但不易除去，需用70%酒精洗涤几次，否则对后续分酒精洗涤几次，否则对后续分子操作有影响。子操作有影响。异戊醇：几乎不能与自由水结合，但可分异戊醇：几乎不能与自由水结合，但可分离有机醇与溶液层，还可去气泡，也可做去蛋白的辅助剂。离有机醇与溶液层，还可去气泡，也可做去蛋白的辅助剂。c. PEG（聚乙二醇，分子量（聚乙二醇，分子量60008000）选择性沉淀）选择性沉淀：低浓：低浓度度PEG（如（如1%）选择沉淀大分子）选择沉淀大分子DNA，在构建基因组文，在构建基因组文库则用低浓度库则用低浓度PEG沉淀几十沉淀几十kb；高浓度；高浓度PEG（20%），），选择

14、沉淀小分子，几百选择沉淀小分子，几百bp。如：。如：PBR322 4.3kb 用用PEG 12%沉淀。沉淀。PEG选择沉淀的分辨率达选择沉淀的分辨率达100bp。沉淀时的注意事项：沉淀时的注意事项：（1 1）当当DNADNA分子量分子量1kb1kb或浓度较低或浓度较低,1g/ml,1kbDNA1kb，加入沉淀剂后再加入糖原，几分钟可，加入沉淀剂后再加入糖原，几分钟可完全；完全；（3 3）DNA200bpDNA1 mmol/L or EDTA10 mmol1 mmol/L or EDTA10 mmol/L/L，则，则用乙醇沉淀得不到用乙醇沉淀得不到 DNADNA，应选其它方法沉淀，应选其它方法沉

15、淀DNADNA。DNA样品的贮存：样品的贮存：44短期贮存短期贮存; ;-20-20长期贮存，冰上缓解冻（取时）；长期贮存，冰上缓解冻（取时）；也可将也可将DNADNA样品以乙醇沉淀的形式保存在样品以乙醇沉淀的形式保存在-20-20。Figure3.4 Preparation of a cell extract.Figure3.5 Removal of protein contaminants by phenol extraction. Figure3.6 Collecting DNA by ethanol precipitation .%两种经典的化学试剂提取法：两种经典的化学试剂提取法：

16、1 1、CTABCTAB法法 2 2、SDSSDS法法 CTAB CTAB法法（1 1）原理：）原理：nCTAB,CTAB,十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵是一种去污剂，可是一种去污剂，可溶解细溶解细胞膜胞膜，它能，它能与核酸形成复合物与核酸形成复合物，在，在高盐溶液高盐溶液中（中（0.7 0.7 mol/L NaClmol/L NaCl）是）是可溶可溶的，当的，当降低溶液盐浓度降低溶液盐浓度到一定到一定程度（程度（0.3 mol/L NaCl0.3 mol/L NaCl）时，）时，从溶液中沉淀从溶液中沉淀，通过，通过离心就可将离心就可将CTABCTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类与

17、核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将物质分开，然后将CTABCTAB与核酸的复合物沉淀溶解于与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTABCTAB能溶解于能溶解于乙醇。乙醇。（2）具体操作：）具体操作：在所需量的在所需量的CTABCTAB抽提液中加入抽提液中加入巯基乙醇，使终浓度达巯基乙醇，使终浓度达2 2（v/vv/v）。将此溶液预热至）。将此溶液预热至6565。对于每克新鲜的叶组。对于每克新鲜的叶组织大约需要织大约需要4ml4ml的的ME/CTABME/CTAB抽提液。抽提液。用液氮（用液氮（196196）或干冰（）或干冰（7878

18、）冷却粉碎器）冷却粉碎器/ /匀浆器，匀浆器，将将0.5 g0.5 g植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到2.0 ml2.0 ml离心管。离心管。加入加入800 800 l l预热的预热的Me/CTABMe/CTAB，混合使之充分湿润，于，混合使之充分湿润，于6565温育温育20min20min，不时颠倒混匀。，不时颠倒混匀。待冷至室温后，加入待冷至室温后，加入800 800 l l氯仿氯仿/ /异戊醇（异戊醇（2424：1 1），颠倒），颠倒混匀至溶液呈乳浊状（但不要振荡）。混匀至溶液呈乳浊状（但不要振荡）。2525，10000 rpm10000 rpm离

19、心离心10 min10 min。上清（约上清（约700 700 l l）转移至另一干净的离心管中，加入）转移至另一干净的离心管中，加入5 5 l RNaseAl RNaseA贮液，贮液，3737温育温育30 min30 min。加入加入700 700 l l氯仿氯仿/ /异戊醇，颠倒混匀，异戊醇，颠倒混匀，2525，10000 10000 rpmrpm离心离心10 min10 min。上清（约上清（约600 600 l l）转移至另一干净的）转移至另一干净的1.5 ml1.5 ml离心管中，离心管中，加入加入600 600 l l异丙醇，颠倒混匀，室温或异丙醇，颠倒混匀，室温或-20-20放置

20、放置20 min20 min。 25 25，12000 rpm12000 rpm，离心，离心10 min10 min，收集沉淀。，收集沉淀。去上清，加去上清，加1ml70%1ml70%乙醇洗涤沉淀两次（乙醇洗涤沉淀两次（2525，12000 12000 rpmrpm，离心，离心10 min10 min）晾干晾干DNADNA，溶于，溶于50 50 l ddHl ddH2 2O O，44保存备用。保存备用。（3 3）优缺点：）优缺点： 能很好地去除糖类物质；能很好地去除糖类物质； 在提取的前期能同时得到高含量的在提取的前期能同时得到高含量的DNA及及RNA； 步骤多，复杂，提取的步骤多，复杂，提取

21、的DNA分子量比分子量比SDS法法小。小。（4 4）说明：）说明：巯基乙醇的作用巯基乙醇的作用：a. 是一种蛋白质的辅助变性剂；是一种蛋白质的辅助变性剂；b. 主要作还原剂，加入溶液中可防止整个溶液的氧主要作还原剂，加入溶液中可防止整个溶液的氧化，大大提高化，大大提高DNA得率。由于气体（多酚类物质）得率。由于气体（多酚类物质）刺鼻，通风柜操作。刺鼻，通风柜操作。 SDSSDS法法（1）原理）原理:n利用利用高浓度的高浓度的SDSSDS，在，在较高温度较高温度（55556565）条件下）条件下裂裂解细胞，蛋白质变性，释放出核酸解细胞，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用，然后采用提高盐提高盐浓度及

22、降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最（最常用的是加入常用的是加入5M5M的的KAcKAc于冰上保温，在低温条件下于冰上保温，在低温条件下KAcKAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的上清液中的DNADNA用酚用酚/ /氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的淀水相中的DNADNA。 （2）过程：过程：将将0.3 g0.3 g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至将粉末转至2 ml2 ml离心管中。离心

23、管中。加入加入1.2 ml1.2 ml预热至预热至6565的提取缓冲液（其中加入的提取缓冲液（其中加入3 l3 l 巯基乙醇，增加巯基乙醇，增加DNADNA的稳定性），置的稳定性），置6565水浴中放水浴中放置置3030分钟，不时颠倒混匀。分钟，不时颠倒混匀。加入加入0.45 ml 5M0.45 ml 5M的醋酸钾，混匀，冰浴的醋酸钾，混匀，冰浴2020分钟，在分钟，在10000 rpm10000 rpm离心离心20 min20 min。需要的话，用纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离需要的话，用纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离心管中。心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（加入等体积氯仿：异戊醇（2

24、424：1 1），轻轻颠倒混匀，），轻轻颠倒混匀，12000 rpm12000 rpm离心离心15 min15 min。 转移上清液到另一新离心管中，加转移上清液到另一新离心管中，加5l RNaseA5l RNaseA贮液，贮液，3737温育温育30 min30 min。 加入等体积氯仿：异戊醇（加入等体积氯仿：异戊醇（2424：1 1），轻轻颠倒混匀，），轻轻颠倒混匀，12000 rpm12000 rpm离心离心15 min15 min。 转移上清液到另一新离心管中，加入转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V0.7V异丙醇，异丙醇，轻轻颠倒混匀，轻轻颠倒混匀，-20-20放置放置3030分

25、钟沉淀核酸。分钟沉淀核酸。 25 25，12000 rpm12000 rpm，离心，离心10 min10 min，收集沉淀。，收集沉淀。 弃上清，弃上清，7070乙醇洗两次。凉干乙醇洗两次。凉干DNADNA，溶于，溶于50 50 l l ddH2OddH2O，44保存备用。保存备用。（3 3）与）与CTABCTAB法比较：法比较：SDSSDS法较温和，对法较温和，对DNADNA的切割不大，可获得大分子量的的切割不大，可获得大分子量的DNADNA。故该法可建立基因组文库，多酚类物质的材料。故该法可建立基因组文库，多酚类物质的材料适用。适用。该法极易造成该法极易造成SDS-DNASDS-DNA共沉

26、淀。共沉淀。对对SDSSDS质量要求较高。质量要求较高。称取称取SDSSDS时，动作要缓慢，因时，动作要缓慢，因SDSSDS易于形成微颗粒。溶易于形成微颗粒。溶解时，水应沿壁使水轻缓流下，解时，水应沿壁使水轻缓流下，5656助溶。助溶。 例1：水稻基因组DNA提取n取取3-5 g新鲜水稻叶片，用液氮速冻，在研钵中快速研成粉末状，转新鲜水稻叶片，用液氮速冻，在研钵中快速研成粉末状，转入入50 ml离心管中；离心管中；n立即加入立即加入20 ml预热至预热至65 的提取缓冲液，的提取缓冲液，65 水浴水浴30 min；n加入加入7.5 ml 5M醋酸钾醋酸钾，轻轻混匀，冰上放置，轻轻混匀，冰上放置

27、20 min，4000 rpm离心离心20 min。将上清转入另一干净的。将上清转入另一干净的50 ml离心管中；离心管中；n加入加入15 ml氯仿：异戊醇（氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，），轻轻颠倒混匀，4000 rpm离心离心20 min。将上清转入另一个干净的。将上清转入另一个干净的50 ml离心管中；离心管中；n加入加入15 ml冰预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20 放置放置30 min；n4000 rpm离心离心20 min，弃上清，用，弃上清，用20 ml 70 %的乙醇洗一遍，倒置的乙醇洗一遍，倒置离心管于干净的滤纸，室温晾干沉淀；离心管于

28、干净的滤纸，室温晾干沉淀；n将沉淀重悬于将沉淀重悬于0.6 ml TE缓冲液，加缓冲液，加10 l 10 mg/ml RNA酶，酶，37 保保温温10 min；n转入干净的转入干净的2 ml离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），），12000 rpm离心离心10 min；n将上清转入一干净的将上清转入一干净的2 ml离心管中，加入离心管中，加入1/10体积冰预冷的体积冰预冷的3 M醋酸醋酸钠（钠（pH 5.2），），2倍体积冰预冷的无水乙醇，倍体积冰预冷的无水乙醇，12000 rpm离心离心30 min。弃上清，用弃上清，用70 %的

29、乙醇洗一遍，晾干后，容于的乙醇洗一遍，晾干后，容于500 l TE，保存于，保存于-20 备用。备用。例2：细菌DNA大量提取n吸取吸取1 ml 过夜培养的细菌于过夜培养的细菌于50 ml不加抗生素的不加抗生素的PSA中，中，28，200 rpm 过夜培养；过夜培养；n6000 rpm离心离心5分钟，收集菌体；分钟，收集菌体；n用用50 ml 冰冷的冰冷的1TE冲洗菌体两次；冲洗菌体两次；n将菌体重新打散，悬于将菌体重新打散，悬于20 ml 1TE中；中；n加入（加入（37预消化预消化1小时）的小时）的蛋白酶、蛋白酶、SDS使其终浓度分别为使其终浓度分别为625 g/ml(w/v)及及1.25

30、（w/v）, 冰浴冰浴45分钟至有白色分钟至有白色SDS析出；析出；n室温放置室温放置30分钟，不时轻轻摇动；分钟，不时轻轻摇动；n3%NaCl 饱和的苯酚、苯酚饱和的苯酚、苯酚/氯仿（氯仿（1:1,v/v）及氯仿各抽提一）及氯仿各抽提一次，收集上清于新的离心管；次，收集上清于新的离心管；n加入加入1/10 体积的体积的3M NaAc(pH4.8),再加等体积冰冷的异丙醇，再加等体积冰冷的异丙醇，混匀后置室温混匀后置室温30min ，待出现无色透明的白色絮状，待出现无色透明的白色絮状DNA，用，用Tip头吸出，室温干燥后溶于头吸出，室温干燥后溶于1xTE中；中；nDNA保存于保存于-20oC，

31、可长期保存。，可长期保存。 例例4 4：人类：人类DNADNA提取提取n親手提取自己的親手提取自己的DNAn 作為作為“紀念紀念DNA雙螺旋結構發現五十周年系列展覽雙螺旋結構發現五十周年系列展覽”的的一部分，現場萃取一部分，現場萃取DNA制成挂件模型實驗，昨天在北京王府制成挂件模型實驗，昨天在北京王府井新東安廣場舉行。井新東安廣場舉行。 十幾名學生在英國老師斯蒂娜的指導下親手萃取了自己十幾名學生在英國老師斯蒂娜的指導下親手萃取了自己的絮狀的絮狀DNA，並制作成可愛的挂件，挂在脖子上。據悉，這，並制作成可愛的挂件，挂在脖子上。據悉，這次開放式實驗活動將持續到次開放式實驗活動將持續到3日。日。圖為

32、北京外國語大學學生小周看見自己的圖為北京外國語大學學生小周看見自己的DNA奇跡般地奇跡般地出現在試液中，驚奇不已。出現在試液中，驚奇不已。本報記者吳平本報記者吳平 張紅晉攝影報道張紅晉攝影報道 京華時報京華時報(2003年年10月月2日第日第2版版) 1.2 质粒质粒DNA的提取的提取1 1、碱裂解法、碱裂解法碱裂解法碱裂解法由由BirnboimBirnboim和和DolyDoly设计并于设计并于19791979年发表，基于染年发表，基于染色体色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA变性与复性的差异而达到分离目的。变性与复性的差异而达到分离目的。在在pHpH高达高达12.512.5的碱性条件下

33、，染色体的碱性条件下，染色体DNADNA的氢键断裂，双的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒螺旋结构解开而变性，质粒DNADNA的大部分氢键也断裂，但的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以当以pH4.6pH4.6的的KAcKAc高盐缓冲液调节其高盐缓冲液调节其pHpH至中性时，变性至中性时，变性的质粒的质粒DNADNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体体DNADNA不能复性而形成缠连的网状结构。不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体通过离心，染色体DNADNA与不稳定

34、的大分子与不稳定的大分子RNARNA、蛋白质、蛋白质- -SDSSDS复合物等一起沉淀下来而被除去。复合物等一起沉淀下来而被除去。基本原理：基本原理：Figure3.11 Plasmid purification by the alkaline denaturation method.三种溶液：三种溶液：溶液溶液I：50 mM葡萄糖葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA：pH 8.0；溶液溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液溶液III：3 M 醋酸钾醋酸钾 / 2 M 醋酸醋酸 提取步骤：提取步骤：碱抽提法所用试剂的生化作用碱抽提法所用试剂的生化作用

35、 n提取过程提取过程中所用的材料有：中所用的材料有：LBLB培养基、葡萄糖培养基、葡萄糖/Tris/Tris/EDTA/EDTA溶液溶液(5Ommol/L(5Ommol/L葡萄糖；葡萄糖；25mmol/L 25mmol/L TrisTris HClHCl；pH8.0pH8.0，lOmmollOmmol/L EDTA)/L EDTA)、TETE缓冲液、缓冲液、3mol/L3mol/L乙酸钾溶液、乙酸钾溶液、NaOHNaOH-SDS-SDS溶液、溶菌酶液、溶液、溶菌酶液、异丙醇、异丙醇、100%100%乙醇和乙醇和70%70%乙醇等。乙醇等。 溶菌酶溶菌酶: :溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细溶菌酶

36、是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1-1，4 4糖糖苷键，因而具有溶菌作用。苷键，因而具有溶菌作用。 葡萄糖葡萄糖: :葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止防止DNADNA受机械剪切力作用而降解。受机械剪切力作用而降解。 EDTA:EDTA:EDTAEDTA螯合螯合MgMg2+2+和和CaCa2+2+等金属离子，抑等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对制脱氧核糖核酸酶对DNADNA的降解作用的降解作用, ,同时同时有利于溶菌酶的作用。有利于溶菌酶的作用。 NaOHNaOH-SDS-SDS液液: :NaOHNaOH浓度为浓

37、度为0.2 mol/L0.2 mol/L，加抽，加抽提液时，该系统的提液时，该系统的pHpH就高达就高达12.612.6，因而促，因而促使染色体使染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA的变性。的变性。nSDSSDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为白质结合成为R-O-S0R-O-S03 3- -R R+ +一蛋白质的复合一蛋白质的复合物物, ,使蛋白质变性沉淀下来。使蛋白质变性沉淀下来。KAcKAc:

38、: pH4.8pH4.8的的KAcKAc溶液是为了把溶液是为了把pHl2.6pHl2.6的抽的抽提液调节至中性，使变性的质粒提液调节至中性，使变性的质粒DNADNA能够复能够复性，并能稳定存在。性，并能稳定存在。n高盐：高盐：3mol/L KAc3mol/L KAc有利于变性的大分子染有利于变性的大分子染色体色体DNADNA、RNARNA以及以及SDS-SDS-蛋白复合物的凝聚蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体而沉淀。染色体DNADNA因为中和了核酸上的电因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与RNARNA、SDS-SDS-蛋白复合物作用后，形成钾盐形式

39、复蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。合物，使沉淀更完全。 无水乙醇无水乙醇: :沉淀沉淀DNADNA，它的优点是可以任意比例和水相混，它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNADNA很安全。很安全。DNADNA溶液是溶液是DNADNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去醇会夺去DNADNA周围的水分子，使周围的水分子，使DNADNA失水而易于聚合。失水而易于聚合。 酚酚- -氯仿氯仿: :酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，

40、当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNADNA分分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。异戊醇异戊醇: :异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同

41、时异戊醇有助于分相，使离心后的上层泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 2、通过试剂盒分离纯化质粒、通过试剂盒分离纯化质粒DNA 分离纯化过程是通过一个简单的结合洗涤洗脱程序来完成的。 优点：该方法操作简单，回收效率高，洗脱出来后的DNA可立即使用，无需浓缩、沉淀或脱盐。 1.3 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分离纯化的分离纯化的DNADNA是否真的存在、是否有降解现是否真的存在、是否有降解现象，以及象，以及DNADNA经限制性内切酶酶切后其产物的经限制性内切酶酶切后其产物的大小如何等都是

42、在基因操作中时刻面对的问题。大小如何等都是在基因操作中时刻面对的问题。目前最成熟的检测目前最成熟的检测DNADNA的技术就是琼脂糖凝胶的技术就是琼脂糖凝胶电泳。电泳。一、琼脂糖的特点及凝胶电泳的原理一、琼脂糖的特点及凝胶电泳的原理 琼脂糖琼脂糖是从海藻中提取出的一种线性多糖是从海藻中提取出的一种线性多糖聚合物。在高温水溶液中会溶解，在常温下凝聚合物。在高温水溶液中会溶解，在常温下凝固并形成一定大小孔径的惰性介质。在电场的固并形成一定大小孔径的惰性介质。在电场的作用下，作用下，DNADNA可在孔洞中迁移。可在孔洞中迁移。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持物，在适当是以琼脂糖为支持物，在

43、适当条件下对带电生物大分子进行电泳的技术。主条件下对带电生物大分子进行电泳的技术。主要用于要用于DNADNA分子的分离、纯化和鉴定。分子的分离、纯化和鉴定。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖凝胶电泳的原理：DNADNA分子在溶液中带分子在溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，由于负电荷，在电场中向正极移动，由于DNADNA分子分子的分子质量差别，电泳后不同大小的的分子质量差别，电泳后不同大小的DNADNA分子分子呈现迁移位置的差异，把已知分子质量的标准呈现迁移位置的差异，把已知分子质量的标准DNADNA与待测与待测DNADNA同时电泳，比较两者在凝胶板上同时电泳，比较两者在凝胶板上所呈现的区带，就可以

44、鉴定出待测所呈现的区带，就可以鉴定出待测DNADNA的大小。的大小。二、琼脂糖凝胶电泳基本操作步骤二、琼脂糖凝胶电泳基本操作步骤 在琼脂糖中加入电泳缓冲液在琼脂糖中加入电泳缓冲液微波加热溶解微波加热溶解温温度降至度降至6060左右时，加入电泳染料左右时，加入电泳染料混匀后倒入凝混匀后倒入凝胶槽胶槽待凝胶完全凝结后，小心拔去梳子待凝胶完全凝结后，小心拔去梳子放入电放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液，缓冲液高过凝胶面泳槽中，倒入电泳缓冲液，缓冲液高过凝胶面0.5cm 0.5cm 点样点样根据需要设置电泳电压和时间，开始电泳根据需要设置电泳电压和时间，开始电泳电泳结束后在凝胶成像仪上观察、照相电泳结束后在

45、凝胶成像仪上观察、照相进一步进一步分析。分析。琼脂糖凝胶电泳的操作过程琼脂糖凝胶电泳的操作过程染色体染色体DNADNA琼脂糖电泳图谱琼脂糖电泳图谱电泳结果分析：电泳结果分析： 0.8%0.8%的琼脂糖凝胶，应呈现一条清晰带。的琼脂糖凝胶，应呈现一条清晰带。若呈长带状弥散荧光则表明若呈长带状弥散荧光则表明DNADNA降解降解, ,原因可能有：原因可能有： 是否灭菌器皿及试剂；是否灭菌器皿及试剂； 材料收集是否立即冷冻，材料收集是否立即冷冻，研磨（后）提取是否融化；研磨（后）提取是否融化； 是否剧烈振动，吸管是否剧烈振动，吸管口过窄，产生气泡。反复吸打及冻融等问题。口过窄，产生气泡。反复吸打及冻融

46、等问题。若在溴酚蓝处出现明亮的荧光，则有若在溴酚蓝处出现明亮的荧光，则有RNARNA，可用，可用RNaseRNase消化。消化后用氯仿抽提，乙醇沉淀方法纯化。消化。消化后用氯仿抽提，乙醇沉淀方法纯化。若在样品槽内有荧光出现，可能样品中若在样品槽内有荧光出现，可能样品中DNADNA未完全溶未完全溶解或浓度过高，或样品不纯，可能是大量带正电荷的解或浓度过高，或样品不纯，可能是大量带正电荷的杂质与杂质与DNADNA样品结合。样品结合。 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA片段的大小范围（片段的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖50000 10000.7%琼脂糖20000 10001.4%琼脂糖

47、6000 3004.0%聚丙烯酰胺1000 10010.0%聚丙烯酰胺500 2520.0%聚丙烯酰胺 50 1 三、琼脂糖凝胶电泳的影响因素三、琼脂糖凝胶电泳的影响因素1 1、凝胶浓度、凝胶浓度 凝胶浓度的选择取决于凝胶浓度的选择取决于DNADNA分子的大小。具体的浓分子的大小。具体的浓度及分离度及分离DNADNA片段的大小范围如下表。片段的大小范围如下表。 2 2、DNADNA分子的大小和构象分子的大小和构象线状双链线状双链DNADNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶上电分子在一定浓度琼脂糖凝胶上电泳距离与泳距离与DNADNA的分子质量对数成反比。的分子质量对数成反比。但当但当DNADNA分子处于

48、不同构象时，它在电场中移分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子质量有关，还和它本身构象动距离不仅和分子质量有关，还和它本身构象有关。有相同分子质量的线状有关。有相同分子质量的线状DNADNA开环状开环状DNADNA超螺旋超螺旋DNADNA。3 3、电泳缓冲液、电泳缓冲液目前目前常用的缓冲液常用的缓冲液有有TAETAE（40 mol/L Tris40 mol/L Tris- -乙乙酸、酸、1 mmol1 mmol/L EDTA/L EDTA）和）和TBETBE（90 mmol90 mmol/L /L 硼酸、硼酸、1 mmol1 mmol/L EDTA/L EDTA）。）。TAETAE缓

49、冲液的缓冲能力较低，适用于低电压长缓冲液的缓冲能力较低，适用于低电压长时间电泳；时间电泳；TBETBE有较强的缓冲能力，是比较通有较强的缓冲能力，是比较通用的缓冲液。用的缓冲液。4 4、指示剂、指示剂 电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。目前常用的核酸电泳指示剂是溴酚样品的迁移过程。目前常用的核酸电泳指示剂是溴酚蓝，呈蓝紫色。蓝，呈蓝紫色。5 5、染色、染色溴化乙锭溴化乙锭（ethidium bromide, EB）可很好地掺入到双链）可很好地掺入到双链DNA中，中，在紫外光的激发下会呈现橙红色的荧光，便于鉴定，可用于对在紫外光的

50、激发下会呈现橙红色的荧光，便于鉴定，可用于对DNA进行染色和观察。进行染色和观察。 SYBR Green I : 新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较EB贵。贵。 强烈诱变剂强烈诱变剂1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）可很好的分辨）可很好的分辨100bp-1kb100bp-1kb大小的核酸分子。对单链大小的核酸分子。对单链DNADNA来说，其分辨来说，其分辨率可达率可达1bp1bp，这种分辨能力在，这种分辨能力在DNADNA序列测定中发挥了重序列测定中发挥了重要作用。要作用。

51、特点特点：分辨率高；载样量大；回收：分辨率高；载样量大；回收DNADNA纯度高；纯度高；适于寡聚核苷酸及适于寡聚核苷酸及DNADNA序列分析，序列分析，DNA500bpDNA4000kb。DNA分子的迁分子的迁移方向随所用电场方向的周期性变化而不断改变。可移方向随所用电场方向的周期性变化而不断改变。可成功分离到分子量高达成功分离到分子量高达107bp的的DNA大分子。大分子。 脉冲场凝胶电泳实际上是一种交替变化电场方向的电脉冲场凝胶电泳实际上是一种交替变化电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场方向，使泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场方向，使DNADNA分子在微观上按分子在微观

52、上按“Z”Z”字形向前泳动，从而到达分字形向前泳动，从而到达分离大分子离大分子DNADNA的目的。的目的。与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用采用定时改变电场方向的交变电源定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后，每次电流方向改变后持续持续1 1秒到秒到5 5分钟左右，然后再改变电流方向，反复循分钟左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。环，所以称之为脉冲式交变电场。脉冲场凝胶电泳的工作方式脉冲场凝胶电泳的工作方式：横向交变电泳（：横向交变电泳（TAFETAFE）、）、场翻转凝胶电泳（场翻转凝胶电泳（FIGEFIG

53、E）、旋转凝胶电泳和箝位匀场）、旋转凝胶电泳和箝位匀场电泳（电泳（CHEFCHEF）。其中使用最广泛的是）。其中使用最广泛的是CHEFCHEF。+- - -2 2脉冲电泳槽电泳仪冷凝器真空泵BIio-RadBIio-Rad公司公司CHEF-DRCHEF-DR脉冲电泳仪脉冲电泳仪影响脉冲场凝胶电泳的因素影响脉冲场凝胶电泳的因素：脉冲时间、分子：脉冲时间、分子大小、电场强度、温度和电场间角度。大小、电场强度、温度和电场间角度。若分子重新定向时间和脉冲时间的比值在若分子重新定向时间和脉冲时间的比值在0.1-0.1-1 1之间，对较长的之间，对较长的DNADNA片段的分离具有最佳的分片段的分离具有最佳

54、的分辨率。辨率。1.6 DNA片段的纯化片段的纯化1、低熔点琼脂糖凝胶电泳法、低熔点琼脂糖凝胶电泳法 琼脂糖总体上可分为两类：普通琼脂糖和琼脂糖总体上可分为两类：普通琼脂糖和低熔点（低熔点（LMP ）琼脂糖。）琼脂糖。 LMPLMP琼脂糖的熔点为琼脂糖的熔点为62-6562-65，其一旦溶，其一旦溶解，便可在解，便可在3737持续保持液体状态达数小时，持续保持液体状态达数小时，而在而在2525下也可持续保持液体状态约下也可持续保持液体状态约10 min10 min。纯化步骤纯化步骤：用：用LMPLMP琼脂糖凝胶分离特定的琼脂糖凝胶分离特定的DNADNA片段片段切切割带有目的割带有目的DNADN

55、A的琼脂糖凝胶块的琼脂糖凝胶块加入适量缓冲液加入适量缓冲液加热到加热到6060使凝胶溶化，使凝胶溶化，DNADNA进入水溶液中进入水溶液中通过苯通过苯酚酚/ /氯仿抽提和乙醇沉淀氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的获得纯化的DNADNA片段。片段。（这（这是经典的是经典的DNADNA片段回收方法，现在一般比较少用。）片段回收方法，现在一般比较少用。）其在回收大片段其在回收大片段DNADNA时仍是一个比较好的办法，在回时仍是一个比较好的办法，在回收大片段收大片段DNADNA时在加热融化后常用琼脂糖酶水解琼脂时在加热融化后常用琼脂糖酶水解琼脂糖，从而减少残留的杂质，提高回收效率。糖，从而减少残留的杂质，提

56、高回收效率。2、透析袋电洗脱法、透析袋电洗脱法 纯化步骤纯化步骤：将含有目的：将含有目的DNADNA片段的琼脂糖凝胶块切割下来片段的琼脂糖凝胶块切割下来放在透析袋中放在透析袋中置于电泳缓冲液中电泳置于电泳缓冲液中电泳DNADNA分子在电场作分子在电场作用下从凝胶块中游离出来，贴在透析袋内壁上用下从凝胶块中游离出来，贴在透析袋内壁上取出凝胶块取出凝胶块更换新鲜缓冲液，反向电泳，使更换新鲜缓冲液，反向电泳，使DNADNA游离于缓冲液中游离于缓冲液中取取出含出含DNADNA的缓冲液的缓冲液通过苯酚通过苯酚/ /氯仿抽提和乙醇沉淀氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯获得纯化的化的DNADNA分子。分子。 透析袋电

57、洗脱法现在多用来纯化相对分子量较大的透析袋电洗脱法现在多用来纯化相对分子量较大的DNADNA片片段。段。 3、Glass Milk （bead）结合法）结合法该方法涉及两个关键技术：该方法涉及两个关键技术： 琼脂糖凝胶在琼脂糖凝胶在3 3倍体积的倍体积的3 3 mol/L NaImol/L NaI 溶液作用下与溶液作用下与5555会溶化，从而使会溶化，从而使DNADNA释放到水释放到水溶液中；溶液中； 在这样的高盐浓度下有一种硅粒（在这样的高盐浓度下有一种硅粒（glass beadglass bead，硅的细微颗粒，其水溶液呈牛奶状，故也成为玻璃奶，硅的细微颗粒，其水溶液呈牛奶状，故也成为玻璃

58、奶，glass milkglass milk）可特异性吸附）可特异性吸附DNADNA。当硅粒吸附当硅粒吸附DNADNA后，通过离心的方法很容易对硅粒进行洗涤，后，通过离心的方法很容易对硅粒进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的DNADNA洗脱出来。洗脱出来。该方法操作简便，回收效率高，易于推广。但回收的该方法操作简便，回收效率高，易于推广。但回收的DNADNA片片段一般不超过段一般不超过10kb10kb，否则回收效率低。，否则回收效率低。 4、纯化试剂盒纯化、纯化试剂盒纯化DNA 目前已有纯化各类目前已有纯化各类DNA的商品试剂盒，大部分都是使的

59、商品试剂盒，大部分都是使用带硅胶膜的纯化柱吸附用带硅胶膜的纯化柱吸附DNA，再经过洗涤、洗脱步，再经过洗涤、洗脱步骤得到纯化的骤得到纯化的DNA。该方法操作简便快速，且纯化效果好。但其只对小于该方法操作简便快速，且纯化效果好。但其只对小于10kb的的DNA片段有好的纯化效果，且价格相对于其片段有好的纯化效果，且价格相对于其他方法较昂贵。（目前也有一些公司开发出可以纯化他方法较昂贵。（目前也有一些公司开发出可以纯化20kb DNA的纯化试剂盒，有些还可纯化回收到的纯化试剂盒，有些还可纯化回收到50kb左右的左右的DNA片段）片段）1.7 DNA或或RNA的紫外分光光度法测定纯度的紫外分光光度法测

60、定纯度 定量测定定量测定DNADNA或或RNARNA时需要读取时需要读取260nm260nm和和280nm280nm两个波两个波长下的读数。根据长下的读数。根据260nm260nm处的读数可计算出样品中处的读数可计算出样品中核酸的浓度，核酸的浓度，1 1个个ODOD值相当于约值相当于约50 50 g/ml g/ml 双链双链DNADNA、40 40 g/mlg/ml单链单链DNADNA和和RNARNA及及33 33 g/mlg/ml单链寡核苷酸。单链寡核苷酸。利用利用OD260OD260和和OD280OD280的比值可计算出核酸的纯度，的比值可计算出核酸的纯度，DNADNA的纯制品的纯制品OD