时间分辨培训

1、上海新波生物技术有限公司q时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。 qTRFTRF的标记物及特点。 q为什么叫“时间分辨”? qTRF在免疫分析方法学中的地位。q各种免疫方法学的比较。放射免疫（精度：10-12mol/L ）酶联免疫（精度：10-9 mol/L ）化学发光（精度：10-15mol/L ）n电化学发光 （精度：10-17mol/L ）时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ）生物芯片 （未知） 待测物质浓度与检测手段待测物质浓度与检测手段 临床化学分析临床化学分析pg/mLng/mLm mg/mLmg/mLg/L免疫分析免疫分析Therapeutic Drugs (药物浓度)Thy

2、roid Hormone (甲状腺激素)Fertility Hormone (孕激素)Cancer Markers (肿瘤标记物)Infectious Disease (传染病)Vitamins (维生素)Serum Proteins (血清蛋白)10-1210-910-610-310-0各种免疫方法学的比较各种免疫方法学的比较放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）125I的半衰期短而导致

3、其试剂有效期短。标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。操作繁琐，出报告时间长。无法保存备用。酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。衍生技术：n荧光酶免疫分析n增强化学发光酶免疫技术曾经一度被认为是取代放免的检测手段。灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。单个样本单个样本检测速度快，适合做急诊。灵敏度较高。自动化程度高。仪器种类：n拜耳 ACS180 系列n雅培 AXSYMn贝克曼 ACCESSn德普 IMMULITE样品不能重复检测；出现故障则整批试剂

4、及血样报废。本底较高，易受环境物质干扰。仪器故障率较高。标准曲线稳定性较差，需多次定标。检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。非开放性试剂；试剂价格高。80年代末期问世的新型化学化学发光发光免疫分析方法。基本原理：根据三联吡啶钌Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应。本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。仪器检测速度慢 （罗氏公司）ECL1010 60 测试/小时ECL2010 90 测试/小时非开放性试剂系统、不能做科研。试剂价格过高。用三价稀土离子离子及其螯合物作为示踪物，代替、和，标记抗原、抗体、核酸探针等物质；当免疫过程结束后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱

5、荧光光谱的物理特点 （、 、 ），并采用解离-增强技术（ DELFIA）放大有效荧光；最后用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据已知浓度所确定的标准曲线，来判断未知样品的浓度值，以达到定量分析的目的。时间分辨荧光免疫原理图（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：n铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、铽(Te)镧系元素荧光特点：n荧光寿命极长荧光寿命极长w镧系元素螯合物（60900 us) w普通荧光免疫中荧光团：1100nsw样本中蛋白质荧光：110ns，易猝灭。nStokes位

6、移大（大约位移大（大约290nm）w铕：发射光613nm、激发光340nm，w荧光素的Stokes位移为28nmn荧光特异性强。（发射光谱带很窄：荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615 5nm）n解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光。而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0发射光谱与激发光谱间存在的巨大StokesStokes位移。可以通过干涉滤干涉滤光片光片将发射光谱与激发光谱完全分离。技术技术特点特点检验先进性检验先进性时间分辨时间分辨光谱分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离背景、高特异性解离解离

7、-增强增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围更宽重复性更好原子标记原子标记 标记位点多，可达20个 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标多标记多标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测多个项目不不 同同 标标 记记 物物 的的 波波 长长0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L 51002000Cps.10 3时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标DELFIA hFSH标准曲线稳定，试剂保质期长标准曲线稳定，试剂保质期长N=6时间分

8、辨荧光免疫的试剂种类时间分辨荧光免疫的试剂种类w甲状腺功能检测甲状腺功能检测nTSH，Ultra TSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TGw性激素类检测性激素类检测nFSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBGw肿瘤标记检测肿瘤标记检测nAFP，CEA，PSA，hTG，-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSA EQM，CA-50，CA-125，CA-199w遗传科检查遗传科检查n产前筛查： hAFP/ HCG ，PAPPAn新生儿筛查：Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OH Prog，PK

9、Uw传染病检测传染病检测nHBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAbw血液科检测血液科检测n贫血检查：Ferritin，Vit B12，Folic acidw科研工具科研工具n单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测零本底、灵敏度高线性范围宽试剂有效期长标准曲线稳定性好易于自动化TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。新波生物徽标新波生物徽标六边形模块六边形模块 - - 象征生物科技象征生物科技细胞形内核细胞形内核 - - 象征企业内涵象征企业内涵多元化组织多

10、元化组织 - - 象征新波个体象征新波个体共同发共同发展展有机合有机合作作多元个多元个体体相互相互促进促进子公司：子公司：上海美生生物技术有限公司苏州新波生物技术有限公司广州新波生物技术有限公司陕西新波生物技术有限公司青岛新波生物技术有限公司经销商：经销商：公司简介公司简介 上海新波生物技术有限公司上海新波生物技术有限公司是一家新近成立于上海浦东张江高科技开发区的高新技术企业，是国际上少数几家掌握“时间分辨荧光免疫”检测技术的厂家之一。 新波生物致力于这一新技术的研究，现已在方法学研究、试剂合成、标记物的制备、抗原抗体纯化、检测仪器的生产等方面均取得了很大成果。 2000年在国内首家推出了AN

11、YTEST2000型时间分辨荧光免疫检测系统，并列为上海市高新技术项目；与此仪器配套的试剂种类多达82种，其中58项用于临床检验、24项用于科研。仪器种类（DELFIA）全自动 AutoDELFIA 1235 （WALLAC）半自动 VICTOR2 1420 （WALLAC）半自动 ANYTEST2000 （上海新波） 半自动半自动半自动 DELFIA 1234/1232 DELFIA 1234/1232 DELFIA 1234/1232 （WALLAC WALLAC WALLAC 停产）停产）停产）全自动 AutoDELFIA 1235自动的操作界面简洁的参数设置清晰的试剂图示快速的检测过程

12、6个项目、480个测试半自动 VICTOR2 1420VICTOR2 1420 操作界面半自动 ANYTEST2000Anytest2000 时间分辨检测仪试剂的多样性试剂的多样性1. 种类多达82种，其中临床58项、科研24项2. 每年推出新诊断试剂盒（根据客户不同需求而开发） 仪器的先进性仪器的先进性 1. 高灵敏度： 10 -18 mol/L（Eu 3+）2. 线性范围宽： 10 -13 mol/L 10 -18 mol/L3. 高稳定性： 1 %4. 快速测试： 1秒样5. 标本量灵活： 适合每天1400份标本量6. 适用范围： 各类大小型的医院、生化实验室7. 应用于临床检测和科学试

13、验8. 标准曲线、测试数据长期保存、共享9. 智能化操作软件 价格的可比性价格的可比性 1. 进口试剂国内分装价格与进口酶标试剂可比性2. 专为中国设计的仪器价格与进口计数仪的可比性友好的主界面简洁的操作过程强大的数据处理nEgate2310全自动洗扳机n2510变频振荡器 q操作界面简洁明了q内置16种洗涤程序（用户可编辑）q洗涤程序可长期保存q两种自动清洗模式（WASH、RINSE）q消毒功能（DISINFECTION）q300uL洗液标准量的校准q机械位置随意调整，适合各种规格微孔板、条的洗涤均匀旋转式振动，使得微孔内的免疫反应可以在孔内壁上均匀进行。采用变频设计，使得振荡频率不受负载变

14、化影响；避免了因负载发生改变导致频率漂移的状态发生。乙肝表面抗原免疫反应图乙肝表面抗原免疫反应图 （时间分辨荧光法）乙肝表面抗体免疫反应图乙肝表面抗体免疫反应图 （时间分辨荧光法）乙肝抗原免疫反应图乙肝抗原免疫反应图 （时间分辨荧光法）乙肝抗体免疫反应图乙肝抗体免疫反应图 （时间分辨荧光法）乙肝核心抗体免疫反应图乙肝核心抗体免疫反应图 （时间分辨荧光法）试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：HBsAg分析类型分析类型: IFMA 定标方式：定标方式： 常数定标常数定标本底处理：本底处理： 随定标时变化随定标时变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴：LOG-B标准

15、品标准品A：BLANK加入线性参比品及待检样本 100uL 孵育 室温下振荡器上缓慢振动1小时 配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）1151.52303.03454.54606.05757.56909.0710510.5812012洗板洗板4次加入铕标记物工作液 100ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动 1小时洗板 洗板6次加入增强液 100uL慢速振动5分钟 检测使用HBsAg测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：HBsAb分析类型分析类型: IFMA 定标方式：定标方式： 常数定标常数定标本底处理：本底处理： 随定标时变化随定标时变化曲线拟合方式曲线

16、拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴：LOG-B标准品标准品A：BLANK加入线性参比品及待检样本 100uL 孵育 室温下振荡器上缓慢振动1小时 配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）1301.52603.03904.541206.051507.561809.0721010.5824012洗板洗板4次加入铕标记物工作液 100ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动 1小时洗板 洗板6次加入增强液 100uL慢速振动5分钟 检测使用HBsAg测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：HBeAg分析类型分析类型: IFMA 定标方式：定标方式： 常数

17、定标常数定标本底处理：本底处理： 随定标时变化随定标时变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴：LOG-B标准品标准品A：BLANK加入线性参比品及待检样本 100uL 孵育 室温下振荡器上缓慢振动1小时 配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）1151.52303.03454.54606.05757.56909.0710510.5812012洗板洗板4次加入铕标记物工作液 100ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动 1小时洗板 洗板6次加入增强液 100uL慢速振动5分钟 检测使用HBsAg测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目

18、：HBeAb分析类型分析类型: FIA 定标方式：定标方式： 线性定标线性定标本底处理：本底处理： 不变化不变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴：LOG-B标准品标准品A：0加入线性参比品及待检样本 50uL 再加入HBeAg中和抗原 50ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动1小时 配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）1151.52303.03454.54606.05757.56909.0710510.5812012洗板洗板4次加入铕标记物工作液 100ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动 1小时洗板 洗板6次加入增强液 100uL

19、慢速振动5分钟 检测使用HBeAb测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：HBcAb分析类型分析类型: FIA 定标方式：定标方式： 线性定标线性定标本底处理：本底处理： 不变化不变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴：LOG-B标准品标准品A：0加入样本稀释液10ul加入线性参比品及待检样本 50uL再加入HBcAg中和抗原 50ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动1小时 配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）1151.52303.03454.54606.05757.56909.0710510.5812012洗板洗板4次加入

20、铕标记物工作液 100ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动 1小时洗板 洗板6次加入增强液 100uL慢速振动5分钟 检测使用HBcAb测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：TSH分析类型分析类型: IFMA 定标方式：定标方式： 常数定标常数定标本底处理：本底处理： 随定标时变化随定标时变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴：LOG-B标准品标准品A： BLANK配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）1751.521503.032254.5-加入线性参比品及待检样本 100ul加入稀释后的铕标记 100ul孵育 室温下振荡

21、器上缓慢振动 1小时洗板 洗板6次加入增强液 150uL慢速振动5分钟 检测使用TSH测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：TT3分析类型分析类型: FIA 定标方式：定标方式： 线性定标线性定标本底处理：本底处理： 不变化不变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴：LOGIT标准品标准品A：0配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）1303.02606.03909.0-加入线性参比品及待检样本 25ul加入稀释后的铕标记 150ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动 1小时洗板 洗板6次加入增强液 150uL慢速振动5分钟 检测

22、使用TT3测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：FT3分析类型分析类型: FIA 定标方式：定标方式： 线性定标线性定标本底处理：本底处理： 不变化不变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴：LOGIT标准品标准品A：0配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）1303.02606.03909.0-加入线性参比品及待检样本 25ul加入稀释后的铕标记 150ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动 1小时洗板 洗板6次加入增强液 150uL慢速振动5分钟 检测使用FT3测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：TT4分析类型分析类

23、型: FIA 定标方式：定标方式： 线性定标线性定标本底处理：本底处理： 不变化不变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴：LOGIT标准品标准品A：0配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）1603.021206.031809.0-加入线性参比品及待检样本 25ul加入稀释后的铕标记 150ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动 1小时洗板 洗板6次加入增强液 150uL慢速振动5分钟 检测使用TT4测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：FT4分析类型分析类型: FIA 定标方式：定标方式： 线性定标线性定标本底处理：本底处理：

24、 不变化不变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴：LOGIT标准品标准品A：0配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）1303.02606.03909.0-加入线性参比品及待检样本 25ul加入稀释后的铕标记 150ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动 1小时洗板 洗板6次加入增强液 150uL慢速振动5分钟 检测使用FT4测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：INSULIN分析类型分析类型: IFMA 定标方式：定标方式： 常数定标常数定标本底处理：本底处理： 随定标时变化随定标时变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条

25、曲线X轴：轴：LOGY轴：轴： LOG-B标准品标准品A： BLANK复溶标准品1.0ml去离子水，至少20分钟复溶标记物1.0ml去离子水，至少20分钟配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）11203.022406.033609.0-加入线性参比品及待检样本 50ul加入稀释后的铕标记 100ul孵育 室温下振荡器上缓慢振动 30分钟洗板 洗板6次加入增强液 200uL慢速振动5分钟 检测使用INSULIN测定程序 试剂操作介绍试剂操作介绍项目：项目：C-PETIDE分析类型分析类型: IFMA 定标方式：定标方式： 常数定标常数定标本底处理：本底处理： 随定标时变化随定标时变化曲线拟合方式曲线拟合方式: 样条曲线样条曲线X轴：轴：LOGY轴：轴： LOG-B标准品标准品A： BLANK复溶标准品1.0ml去离子水，至少20分钟配制铕标记物工作液（见右表） 条铕标记物（ul）铕标记物稀释液（ml）11203.022406.033609