Westernblot实验技术

1、Western blot 实验技术 定义：n印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。n1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。n而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法Western Blot基本原理基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种

2、固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。n蛋白样品的制备nSDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色 蛋白样品的定量Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量)试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/

3、ml, 0.5mg/ml。）管号012345678ddH2O807070707070707070蛋白标准液01010101010101010样品101010101010101010HCL101010101010101010SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电

4、价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵(时间)MTris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶成份凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212转膜半干法半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。

5、只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。 一抗、二抗孵育n把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4 过夜。n倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。n加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37一小时，4 过夜。n倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP)？ 背景太高膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高 原原因因对对策策转膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜完甲醇将膜完全浸湿全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转