发酵实验报告二、根霉曲糖化能力的测定

1、发酵工程学实验报告实验二 根霉曲糖化能力的测定学 院生命科学学院 专 业应用生物教育班 级12应生A班 姓名李顺昌 学号124120218 实验课程根霉曲的制备 指导教师许 波开课学期20142015学年下学期 实验二 根霉曲糖化能力的测定 小组合作：是 小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤 1、 实验目的1.了解标准曲线的制作和使用方法2.掌握DNS（3,5-二硝基水杨酸）法测定糖化酶活力的基本原理和方法3.学会计算糖化酶的糖化DE二、实验设备与材料1.设备：天平、烧杯、三角瓶、水浴锅、离心机、722分光光度计等2.材料：根霉曲、柠檬酸缓冲液、DNS、0.1%葡萄糖溶液、1%淀粉溶液三、

2、实验原理1.淀粉：由葡萄糖通过-1,4糖苷键构成的直链淀粉和-1,6位有分支的支链淀粉组成，其水解需淀粉酶和糖化酶的作用；淀粉酶的作用：首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖；糖化酶的作用：其次通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降解为还原性的单糖。2.DNS法：利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。3.DE（Dextrose Equivalent，葡萄糖值）：是糖化液中还原糖（以葡萄糖计）占干物质的百分比，工业上用DE值表示

3、淀粉的水解程度或糖化程度。四、实验方法步骤1.绘制标准曲线的方法先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定吸光度A。以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。2.待测酶液的制备烘干：把发酵产物倒于平皿中，50烘干；制备酶粉：将烘干的发酵产物用研钵研磨成粉状（尽量磨细），装于塑料袋中备用；制备酶液：称取1g根霉曲粉，充分溶解于30mL缓冲液(即稀释30倍)，纱布（4层）过滤去除杂质，滤液备用。3. 糖化酶酶活测定方法酶活定义：在50、p

4、H4.8条件下，每分钟内每毫升酶液降解淀粉底物产生1moL葡萄糖所需要的酶量定义为一个国际单位（IU）。酶活计算公式：酶活(IU)=(K×OD+b) ×N ×1000/180.2/0.2/10K: 标准曲线的斜率；N：稀释倍数；1000：转换因子1mg=1000g180.2：葡萄糖分子量；0.2：酶液体积；10：反应时间（min）4.糖化DE值的计算 DE%=还原糖含量/淀粉含量×100 计算公式=(K×OD+b)*15/（1.8 ×1% ×1000) × 1005.淀粉酶的液化效果检测6.试验注意事项试管上编号：

5、贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时。五、实验报告（一）实验现象、数据及结果 1.标准曲线测量结果葡萄糖溶液体（ml）0.00.20.40.60.81.01.2葡萄糖含量（mg）0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS (ml)3333333沸水浴煮沸5min流水冷却,加蒸馏水10mL，

6、混匀定容总体积(ml)15151515151515OD（540nm）0.0840.1030.4150.4840.7921.0361.095葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程y=0.9421x+0.0074，k=0.9421，R2=0.9673。式中Y表示测定的吸光度（OD）值，X表示葡萄糖的浓度。2.糖化酶活力测定现象和结果试管编号C试管A试管B试管 OD（540nm）0.000.1820.1793.酶活力单位计算酶活(IU)=(K×（ODa+ODb）/2+b) ×N ×1000/180.2/0.2/10 =（0.9421×（0.182+0.179

7、）/2+0.0074）×30×1000/180.2/0.2/10 =14.7714.糖化DE值的计算DE%=(K×（ODa+ODb）/2+b)*15/（1.8 ×1% ×1000) × 100 =（0.9421×（0.182+0.179）/2+0.0074）*15/（1.8 ×1% ×1000) × 100 =14.78745.淀粉酶的液化效果检测当向加酶液的试管加入碘液时，试管中溶液没有明显的颜色的变化，说明试管中的淀粉已经被酶液所分解，所以加碘液就不会变色；而没有加酶液的试管中溶液变成了蓝色

8、，说明试管中有淀粉的存在，淀粉没有消失。（2） 分析与讨论 根据实验结果和我们所查阅的文献对比，我们实验的所测得的根曲霉糖化活性偏低。分析可能是以下原因造成的： 1、酶的活性受温度、pH等多种因素影响，本次试验只是简单地验证性实验，并未严格控制实验条件，故而测定得到的数据误差较大。 2、糖化酶是诱导酶。当培养环境中淀粉的含量较高时，会诱导微生物形成较多的糖化酶，而本次实验培养时，我们仅仅使用了麦麸，对根曲霉中的糖化酶诱导不够，所以在测定时反应出活性较低。 3、我们在实验过程的研磨、溶解、吸取、滴定等操作存在一定的误差，在待测酶液的制备时，可能由于实验操作原因，导致糖化酶没有完全浸出，导致实验结

9、果有所偏差， 故而导致测定活性较低。（3） 结论 根据实验结果来看，已初步得到具有糖化活性的根曲霉，首先证实了根曲霉的培养成功，其次证明了所培养的根曲霉具有糖化活性，能够分解淀粉产生葡萄糖，已基本达到实验目的。（四）实验总结 1、本次实验成败之处及其原因分析 (1)小组成员分工明确，又团结协作，组员实验动手能力强。  (2)通过老师讲解，我们明白了根酶曲糖化活力测定的原理，掌握了酶活力的测定方法与酶活单位的定义、意义，明确了实验步骤，再加上实验步骤简单，我们在实验过程中信心满满。  (3)由于酶的反应特殊性与复杂综合因素影响因此在酶活力测定过程中，为了减少误差，应

10、该熟悉掌握操作过程，对影响到的诸多因素严格控制，如：对温度严格控制，为了减少视觉误差造成的影响，还可进行实验预滴定。2、本实验的关键环节及改进措施 做好本实验需要把握的关键环节； 称量酶粉时要准确，加热时时间要准确；量取酶液和缓冲液时体积要精确。 若重做本实验，为实现预期效果，仪器操作和实验步骤应如何改善。   酶的活性受时间、温度、pH等因素影响较大，所以在实验过程中应严格控制相关影响因素，其次在加缓冲液和酶液时一定要量取准确，加热时时间要精确，这样才能完美的控制酶促反应的结束，尽量避免人为误差。  3、对实验的自我评价 在本次实验中我积极认真，积极参与到了实验过程中，