实时定量PCR技术

1、实时定量实时定量PCR技术技术 韩东洺韩东洺 2015-07-08目录目录实时定量实时定量 PCR介绍介绍荧光荧光PCR实验设计实验设计Quantitative Real-time PCR技术的应用技术的应用PCR PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一片段的一种方法。由高温种方法。由高温变性变性、低温、低温退火退火及适温及适温延伸延伸等几等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简以迅速扩增，具有特异性

2、强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。便、省时等特点。实时定量实时定量 PCR 实时定量实时定量 PCR (Quantitative real-time PCR) 是是1996年由美国年由美国Applied Biosystems公司推出的一公司推出的一种新技术。是指在种新技术。是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个利用荧光积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 与传统与传统PCR一样用同样的基本成分：一样用同样的基本成分： 双链双链DNA，引物，引物，dN

3、TPs，PCR buffer，Taq酶等。酶等。 与传统与传统PCR一样，反应在温度模块里循环进行：一样，反应在温度模块里循环进行： 双链双链DNA模板变性模板变性 引物与模板碱基互补引物与模板碱基互补-退火退火 引物延伸引物延伸 新的扩增片段新的扩增片段基本原理基本原理 实时荧光定量实时荧光定量 PCR 是在反应体系中加入荧光基团，是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线应为产物的扩增曲线。理想的扩增曲线应为J 型型，符合，符合2 N 方程方程(其中其中 N 为为 PCR 的

4、循环次数的循环次数)，但实际上扩增曲线为，但实际上扩增曲线为 S 型型。 在在 PCR 反应早期，不能将反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入别，之后荧光的产生进入指数指数期期、线性期线性期和最终的和最终的平台期平台期，因此可以在指数期的某一点上因此可以在指数期的某一点上检测检测 PCR 产物的量，并由此产物的量，并由此推断起始模板含量。推断起始模板含量。主要类型主要类型根据根据Quantitative real-time PCR的化学发光原理可以的化学发光原理可以分为分为2大类：大类：1、探针类探针类 包括包括TaqMan探针和分子信标，利

5、用与靶序列特探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；异杂交的探针来指示扩增产物的增加；2、非探针类非探针类 其中包括如其中包括如SYBR Green I或者特殊设计的引或者特殊设计的引物物 (如如 LUX Primers) 通过荧光染料来指示产物的增加。通过荧光染料来指示产物的增加。Taqman 探针法探针法 Taqman 探针法是最早用于定量的方法。探针法是最早用于定量的方法。 特异性的荧光探针特异性的荧光探针：该探针只与模板特异性地结合，其结：该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的合位点在两条引物之间。探针的5端标记有荧光报告基团端标记有荧光报

6、告基团(Reporter, R)，3端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)。该探针在该探针在 PCR过程中不能被延伸。过程中不能被延伸。 每扩增一条每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板代表了模板DNA的拷贝数。因此该技术可对模板进行的拷贝数。因此该技术可对模板进行准确准确定量定量。Taqman 探针法探针法SYBR Green 法法 SYBR Green I 是一种能结是一种能结合到合到 dsDNA 小沟部位

7、的小沟部位的具有绿色激发波长的染料，具有绿色激发波长的染料，与双链与双链DNA结合后，其荧结合后，其荧光大大增强。这一性质使光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非其用于扩增产物的检测非常理想。常理想。SYBR Green 法法是非特异性检测扩增序列是非特异性检测扩增序列的代表。的代表。SYBR Green 法法局限性：局限性：可与所有双链可与所有双链DNA序列结合，从而降低了特异性。序列结合，从而降低了特异性。 为避免假阳性信号，应使用为避免假阳性信号，应使用熔解曲线熔解曲线（melting curve） 或凝胶分析来检查非特异性产物的构成。或凝胶分析来检查非特异性产物的构成。熔解曲线熔

8、解曲线 扩增反应完成后，通过逐渐增加扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线。随着反应中双来产生熔解曲线。随着反应中双链链DNA的变性，荧光染料又恢的变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低，复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的与温度作图，在扩增产物的熔解熔解温度温度上有一特征峰（上有一特征峰（Tm，DNA双链解链双链解链50%的温度），用这个的温度），用这个特征峰可将特异产物与其他产物特征峰可将特异产物与其他产物如引物二聚体区分开，因为它们如引物二聚体区分

9、开，因为它们在不同温度熔解。在不同温度熔解。熔解曲线熔解曲线如果熔解曲线做出来的只有单峰，而且出峰的位如果熔解曲线做出来的只有单峰，而且出峰的位置所对应的退火温度与所需退火温度相同，那么置所对应的退火温度与所需退火温度相同，那么该荧光数据有效。该荧光数据有效。只有一个的峰只有一个的峰= =没没有多余的产物有多余的产物荧光荧光温度温度可能是引物二聚体可能是引物二聚体SYBR Green法和法和Taqman探针法比较探针法比较Quantitative Real-time PCR与常规PCR的比较荧光荧光PCR实验设计实验设计实验操作注意事项实验操作注意事项预防预防RNA酶的污染：酶的污染： 全程佩

10、戴一次性手套、口罩，少说话。全程佩戴一次性手套、口罩，少说话。 使用使用DEPC（焦碳酸二乙酯）（焦碳酸二乙酯）处理并灭菌的器材。处理并灭菌的器材。Mix配制：配制： 试剂不要反复冻融，若经常使用，最好放在试剂不要反复冻融，若经常使用，最好放在4度。度。 每管或每孔都要换新枪头！每管或每孔都要换新枪头！ 所有成分加完后，离心去除气泡。所有成分加完后，离心去除气泡。Real-time PCR引物设计原则引物设计原则Taqman探针设计原则探针设计原则G反应体系优化反应体系优化误差控制误差控制配置预混体系配置预混体系设置设置 生物学重复（不同个体）生物学重复（不同个体） 技术性重复（复孔）技术性重

11、复（复孔）阴性对照阴性对照实时荧光定量检测系统实时荧光定量检测系统 实时荧光定量实时荧光定量 PCR 仪仪普通PCR仪7500型荧光定量仪工作流程工作流程无论是哪个型号，所有的定量无论是哪个型号，所有的定量PCR仪器都有三个仪器都有三个共同的组成部分：共同的组成部分：在扩增的过程中，荧光信号随着在扩增的过程中，荧光信号随着PCR产物的增加产物的增加而增强。而增强。每个循环结束后，定量每个循环结束后，定量PCR仪器通过不同的滤光仪器通过不同的滤光片记录荧光信号的增加。片记录荧光信号的增加。最后，定量最后，定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的软件计算出数据，用于实验结果的分析。分析。基因表达数

12、据分析数据分析 常见参数常见参数 基线基线(baseline)：一般来讲，第一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线。个循环的荧光值就是基线。 荧光阈值荧光阈值(threshold)：PCR反应的前反应的前15个循环的荧光信号作为荧光个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：倍，即：threshold = 10 SD cycle 3-15 。 Ct 值值(Ct value)：C代表Cycle，t代表threshold，因此也称阈值循环(threshold cycle)。Ct值

13、的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。所以Ct值是一个没有单位的参数。影响影响Ct值的关键因素值的关键因素 模板浓度模板浓度：模板浓度是决定：模板浓度是决定Ct值的最主要因素。控制在一个值的最主要因素。控制在一个合适范围内，使合适范围内，使Ct值在值在15-35之间。之间。 反应液成分的影响反应液成分的影响：任何分子的荧光发射都受环境因素影任何分子的荧光发射都受环境因素影响响比如溶液的比如溶液的pH值和盐浓度。值和盐浓度。 PCR反应的效率反应的效率：PCR反应的效率也会影响反应的效率也会影响Ct值。在值。在PCR扩扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与增效率低的

14、条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。 PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。之间都是可以接受的。评估实时定量评估实时定量PCR反应的效果反应的效果数据分析方法数据分析方法 标准曲线法标准曲线法 2CT法法 要使要使CT计算方法有效，目标序列和内参序列的扩计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两个反应是否具有相同的扩增效率的增效率必须相等。看两个

15、反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释后扩增产物方法是看他们模板浓度梯度稀释后扩增产物CT如何变如何变化。化。y = -3.3168x + 24.989R2 = 0.992Quantitative Real-time PCR技术的应用技术的应用 Quantitative Real-time PCR 技术广泛应用于基础技术广泛应用于基础科学研究、临床疾病诊断、疾病研究及药物开发等领域。科学研究、临床疾病诊断、疾病研究及药物开发等领域。在临床医学上应用很多，发挥重要的作用，包括在病毒在临床医学上应用很多，发挥重要的作用，包括在病毒检测诊断方面的应用、在遗传性疾病诊断方面的应用、检

16、测诊断方面的应用、在遗传性疾病诊断方面的应用、在肿瘤诊断方面的应用等。在肿瘤诊断方面的应用等。 在在分子生物学分子生物学方面的应用主要是：方面的应用主要是： 1、基因表达的研究、基因表达的研究 2、基因突变及多态性研究、基因突变及多态性研究 3、转基因研究（、转基因研究（DNA或或RNA的定量检测）的定量检测）1、基因表达的研究、基因表达的研究 在基因表达的研究中，常用的方法有在基因表达的研究中，常用的方法有 Northern 印迹，印迹，RT-PCR 定量法等，而定量法等，而 Quantitative Real-time PCR 比比 Northern 印迹、印迹、RT-PCR 定量法要方便

17、、快速、准确的多。定量法要方便、快速、准确的多。Quantitative Real-time PCR能检测各种组织细胞中能检测各种组织细胞中 基因的表达丰度，从而分析基因的表达调控、监控基因的表达丰度，从而分析基因的表达调控、监控 mRNA 表达模式、检测组织中少量存在的基因、跟踪细表达模式、检测组织中少量存在的基因、跟踪细 胞群体中克隆、定量分析基因在不同组织中的转录水平胞群体中克隆、定量分析基因在不同组织中的转录水平 等。等。 2、基因突变及多态性研究、基因突变及多态性研究 扩增扩增 DNA 的核苷酸序列不需要分子克隆、宿主细胞的核苷酸序列不需要分子克隆、宿主细胞 内的生长准备，即可在媒介

18、中的生物分子纯化过程中直接内的生长准备，即可在媒介中的生物分子纯化过程中直接测得，因此测得，因此 Quantitative Real-time PCR 可用于检测特可用于检测特异突变基因。利用异突变基因。利用Quantitative Real-time PCR 和有关和有关 的间接测序方法，可对已知的间接测序方法，可对已知 DNA 序列进行基因突变及多序列进行基因突变及多 态性的分析。如对已知态性的分析。如对已知 DNA 序列进行位置突变基因及序序列进行位置突变基因及序 列多态性的定位，扩增列多态性的定位，扩增 DNA 限制性位点检测遗传变异限制性位点检测遗传变异 等。等。3、转基因研究、转基因研究 有研究者用有研究者用 Quantitative Real-time PCR 检验转基因检验转基因水稻的外源基因拷贝数，定量分析的外源基因拷贝数与用水稻的外源基因拷贝数，定量分析的外源基因拷贝数与用 so