BiosynthesisofNucleicAcids核酸

1、第十三章第十三章 核酸的生物合成核酸的生物合成Biosynthesis of Nucleic Acids 1958 年年 Crick 提出中心法则的概念：提出中心法则的概念：DNA RNAProtein一、一、DNA的生物合成的生物合成1、信息流与中心法则、信息流与中心法则 1961 年年 法国巴塞尔研究所法国巴塞尔研究所 Jacob 和和 Monod 发现发现 mRNAProteinDNA RNA复制复制转录转录1965 年年 破译了遗传密码破译了遗传密码20 世纪六十年代的信息流概念：世纪六十年代的信息流概念：转译转译翻译翻译1970 年年 美国有两家实验室分别独立地发现了美国有两家实验室

2、分别独立地发现了 逆转录酶。从那时至今，中心法则概逆转录酶。从那时至今，中心法则概 念为：念为：ProteinDNA RNA转译转译逆转录逆转录转录转录复制复制复制复制复制复制：DNA（或（或 RNA）以自己为模板，合成与自己）以自己为模板，合成与自己 完全相同的完全相同的 DNA（或（或 RNA）的过程叫复制。）的过程叫复制。转录转录：以：以 DNA 为模板，按碱基配对原则合成相应为模板，按碱基配对原则合成相应 RNA链的过程，叫转录。链的过程，叫转录。翻译翻译：以：以 mRNA 为模板，按为模板，按 mRNA 上每三个核苷上每三个核苷 酸决定一个氨基酸的原则合成特定多肽链的酸决定一个氨基酸

3、的原则合成特定多肽链的 过程叫翻译（或转译）。过程叫翻译（或转译）。逆转录逆转录：以：以 RNA 为模板，按碱基配对原则合成相应为模板，按碱基配对原则合成相应 DNA链的过程，叫逆转录。链的过程，叫逆转录。 亲代亲代DNA分子分子2、 DNA的半保留复制的半保留复制：DNA复制时，两条链分开，分别复制时，两条链分开，分别以每一条链为模板，按碱基配对原则，合成对以每一条链为模板，按碱基配对原则，合成对应的互补链。结果，由一个应的互补链。结果，由一个 DNA 分子形成了两分子形成了两个与原来的个与原来的 DNA 分子完全相同的分子完全相同的 DNA 分子。分子。由于子代由于子代 DNA 分子中的两

4、条链，一条来自亲代分子中的两条链，一条来自亲代 DNA，另一条是新合成的，所以就称这种复制，另一条是新合成的，所以就称这种复制方式为半保留复制。方式为半保留复制。 15NDNA（14N- -15N）DNA14NDNA（14N- -15N）DNA3、DNA复制的起点和方式复制的起点和方式 复制子复制子：基因组能独立进行复制的单位：基因组能独立进行复制的单位叫复制子，其含有控制复制起始的起点，可叫复制子，其含有控制复制起始的起点，可能还有终止复制的终点。能还有终止复制的终点。复制叉复制叉：DNA合成时的生长点。合成时的生长点。4、原核生物原核生物 DNA 的复制的复制 实验材料：大肠杆菌（实验材料

5、：大肠杆菌（E.coli）、DNA聚合反应有关的酶聚合反应有关的酶、DNA 聚合酶聚合酶 DNA 指导下的指导下的 DNA 聚合酶聚合酶或：或： 依赖于依赖于 DNA 的的 DNA 聚合酶聚合酶 1956年，美国年，美国Kornberg（获（获1959年诺贝尔奖）年诺贝尔奖）（ Kornberg 酶）酶） DNA聚合酶聚合酶：相对分子质量：相对分子质量：103 000，由，由单一链组成，活性部位含有单一链组成，活性部位含有 Zn2+。DNA 聚合酶聚合酶催化反应的条件：催化反应的条件：n1dTTP+DNAn4dCTPn3dGTPn2dATPMg2+DNA Pol1dAMPn2dGMPn3dCM

6、Pn4DNA+dTMPn1(n1+n2+n3+n4)PPi引物引物（模板）（模板） 底物（底物（dNTP）、模板（）、模板（DNA）、）、 引物（必须具有游离的引物（必须具有游离的3- -OH）、）、Mg2+DNA 聚合酶聚合酶的特点：的特点： A聚合反应具有方向性，新合成链的延聚合反应具有方向性，新合成链的延伸方向为伸方向为 5 3聚合反应不能从头开始，必须要有引物。聚合反应不能从头开始，必须要有引物。新合成链的性质完全取决于模板链的性质新合成链的性质完全取决于模板链的性质 模板：模板：DNA DNA 聚合酶聚合酶：E.coliDNA 聚合酶聚合酶是一个多功能的酶：是一个多功能的酶： 具有从

7、具有从 5 3聚合酶功能聚合酶功能 具有从具有从 3 5核酸外切酶功能核酸外切酶功能 具有从具有从 5 3核酸外切酶功能核酸外切酶功能 DNA聚合酶聚合酶：催化：催化DNA合成的速度只有合成的速度只有体内体内 DNA复制速度的复制速度的 1%；持续合成能力低；许；持续合成能力低；许多影响多影响DNA复制的基因突变均与酶复制的基因突变均与酶无关。无关。1969 年发现一年发现一 E.coli 突变株，突变株，DNA 聚合酶聚合酶活力只活力只有野生型酶活力的有野生型酶活力的 0.51%，其复制正常进行，其复制正常进行，但损伤修复功能缺陷。但损伤修复功能缺陷。、DNA 聚合酶聚合酶和和 197019

8、71 年年 DNA 聚合酶聚合酶和和 与聚合酶与聚合酶的的共同点共同点：在聚合反应中，要模：在聚合反应中，要模板、引物、板、引物、Mg2+、dNTP、聚合方向：、聚合方向：5 3、均、均具有具有 3 5核酸外切酶功能。核酸外切酶功能。 与聚合酶与聚合酶的的区别区别：无：无 5 3核酸外切酶功核酸外切酶功能。另外，三个酶的活力（聚合速度、持续合成能。另外，三个酶的活力（聚合速度、持续合成能力）也各不相同。能力）也各不相同。DNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶结构基因结构基因*pol Apol Bpol C=dna E分子数细胞分子数细胞4001001020不同种类亚基数目

9、不同种类亚基数目1710相对分子质量相对分子质量103 00088 000*830 00035核酸外切酶核酸外切酶53核酸外切酶核酸外切酶 聚合速度聚合速度 （核苷酸分）（核苷酸分）1 0001 2002 40015 00060 000持续合成能力持续合成能力32001 500500 000功能功能切除引物、修复切除引物、修复修复修复复制复制 * ：对于多亚基酶，仅列出聚合活性亚基的结构基因：对于多亚基酶，仅列出聚合活性亚基的结构基因* ：仅聚合活性亚基。聚合酶：仅聚合活性亚基。聚合酶和和共有许多辅助亚基共有许多辅助亚基 酶酶的温度敏感条件致死突变株于的温度敏感条件致死突变株于45以上环境中，

10、酶以上环境中，酶将失活。将失活。 酶酶为多亚基酶。为多亚基酶。DNA聚合酶聚合酶全酶由全酶由10个亚基组成，含有个亚基组成，含有 Zn 原子。原子。具催化活性具催化活性具具 3 5外外切酶功能切酶功能组建核心酶组建核心酶使核心酶使核心酶二聚化二聚化具依赖具依赖 DNA 的的ATP 酶活酶活力力夹子装置器，夹子装置器，帮助帮助 -亚基亚基夹住夹住 DNA滑动夹子，使酶滑动夹子，使酶具持续合成能力具持续合成能力在在 复合物的帮复合物的帮助下，助下， 夹子夹夹子夹住模板与引物组住模板与引物组成的双链并转移成的双链并转移到核心酶上，开到核心酶上，开始始 DNA 复制。复制。 -亚基：具聚合酶活性亚基：

11、具聚合酶活性 -亚基：具亚基：具 3 5核酸外切酶校对功能核酸外切酶校对功能 -亚基：组建核心酶（亚基：组建核心酶（、 组成核心酶）组成核心酶） （ Tau） -亚基：负责核心酶的二聚化亚基：负责核心酶的二聚化 -亚基：具依赖亚基：具依赖 DNA 的的ATP 酶活力酶活力 、 （ Chi）及及 （ Psi） -亚基：与亚基：与 -亚亚 基一起形成基一起形成复合物：夹子装置器，帮助复合物：夹子装置器，帮助 -亚亚 基夹住基夹住 DNA -亚基：形成滑动夹子，使酶具持续合成能力亚基：形成滑动夹子，使酶具持续合成能力具催化活性具催化活性具具 3 5外外切酶功能切酶功能组建核心酶组建核心酶使核心酶使核

12、心酶二聚化二聚化具依赖具依赖 DNA 的的ATP 酶活酶活力力夹子装置器，夹子装置器，帮助帮助 -亚基亚基夹住夹住 DNA滑动夹子，使酶滑动夹子，使酶具持续合成能力具持续合成能力在在 复合物的帮复合物的帮助下，助下， 夹子夹夹子夹住模板与引物组住模板与引物组成的双链并转移成的双链并转移到核心酶上，开到核心酶上，开始始 DNA 复制。复制。、DNA 聚合酶聚合酶和和 DNA 聚合酶聚合酶和和于于 1999 年发现，它们年发现，它们涉及涉及 DNA 的错误倾向修复。的错误倾向修复。 当当 DNA 受到严重损伤时，可诱导产生这受到严重损伤时，可诱导产生这两个酶，由于这两个酶对两个酶，由于这两个酶对

13、DNA 的修复缺乏准的修复缺乏准确性，所以出现高的突变率。确性，所以出现高的突变率。 高突变率虽然会杀死许多细胞，但至少高突变率虽然会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活。存活。 动物及一些噬菌体的能量供体是动物及一些噬菌体的能量供体是细菌的细菌的能量供体是能量供体是 、DNA 连接酶（多核苷酸连接酶）连接酶（多核苷酸连接酶） 19671968 年在研究环状年在研究环状 DNA 的复制时发现的复制时发现 DNA 连接酶可催化连接酶可催化 DNA 链上的缺刻（切口：链上的缺刻（切口：nick）封闭）封闭、解链蛋白与解旋蛋白、解链蛋白

14、与解旋蛋白 （E.coli DNA 长长 1 mm。设其。设其 30复制一复制一代。反方向旋转一圈解开代。反方向旋转一圈解开 3.4 nm 的的 10 个碱基个碱基对，则每分钟要旋转：对，则每分钟要旋转：1063.43010 000 转）转）、DNA 解螺旋酶（解螺旋酶（解链酶解链酶：helicase） 由由 ATP 提供能量可解开双螺旋。每消耗提供能量可解开双螺旋。每消耗 2 分子分子ATP，解开，解开 1 个个 bp。E.coli 的参与的参与 DNA 复复制的解螺旋酶为制的解螺旋酶为 Dna B 蛋白，其沿模板链从蛋白，其沿模板链从 5 3方向移动并解链。方向移动并解链。、单链结合蛋白单

15、链结合蛋白（SSB 蛋白）蛋白） E.coli 的的 SSB 蛋白由蛋白由 4 个相同的亚基组成。个相同的亚基组成。其功能在于：其功能在于：稳定解开的稳定解开的 DNA 单链，阻止复性单链，阻止复性并保护单链部分不被核酸酶降解并保护单链部分不被核酸酶降解。、DNA 拓扑异构酶拓扑异构酶 细菌的拓扑异构酶细菌的拓扑异构酶（DNA旋转酶：旋转酶：gyrase） 兼具内切酶和连接酶的活性。在兼具内切酶和连接酶的活性。在 ATP 提供能量的提供能量的情况下，可连续地引入负超螺旋，每分钟可引入情况下，可连续地引入负超螺旋，每分钟可引入约约 100 个负超螺旋。在无个负超螺旋。在无 ATP 存在时，可松弛

16、负存在时，可松弛负超螺旋，但速度较引入负超螺旋慢超螺旋，但速度较引入负超螺旋慢 10 倍。倍。 拓扑异构酶拓扑异构酶引入负超螺旋，可以消除复制引入负超螺旋，可以消除复制时（复制叉前进时）所带来的扭曲张力，从而促时（复制叉前进时）所带来的扭曲张力，从而促进进 DNA 双链的解开。双链的解开。 拓扑异构酶拓扑异构酶 I：？又名又名RNA聚合酶，可催化引物的合成：以聚合酶，可催化引物的合成：以DNA为模板，以四种为模板，以四种NTP为底物，需要为底物，需要Mg2+、合成、合成方向方向53。E.coli 的引物合成酶为的引物合成酶为Dna G蛋白蛋白IV、引物酶、引物酶、DNA 的复制过程的复制过程

17、5 3 3 5 3 5 3 5 双螺旋双螺旋DNA解螺旋方向解螺旋方向 DNA 复制时：复制时：5 3模板链的复制问题模板链的复制问题、DNA的半不连续复制和冈崎片段的半不连续复制和冈崎片段 DNA 复制时的引物复制时的引物1968 年年 日本日本 冈崎冈崎 用用 3H 标记的脱氧胸苷（标记的脱氧胸苷（ 3H- -dTTP DNA）标记被）标记被 T4 噬菌体感染的噬菌体感染的 E.coli，低温，低温（8）下保温一段时间，以蔗糖做密度介质，）下保温一段时间，以蔗糖做密度介质，进行密度梯度离心。发现：短时间内合成的都是进行密度梯度离心。发现：短时间内合成的都是较短的较短的 DNA 片段（片段（

18、810S），时间延长出现较），时间延长出现较大的分子（大的分子（70100S）。）。T4 噬菌体的温度敏感突变株（其噬菌体的温度敏感突变株（其 DNA 连接连接酶在酶在20时有正常的活力，在时有正常的活力，在 44以上时失活）以上时失活）在在44条件下培养，条件下培养，E.coli 体内积累大量的小片体内积累大量的小片段段 DNA。 前导链前导链滞后链滞后链复制叉移动方向复制叉移动方向冈崎片段冈崎片段冈崎片段冈崎片段：指以亲代：指以亲代 5 3链为模板，沿着链为模板，沿着 与复制叉相反的方向所合成的一些小片段。与复制叉相反的方向所合成的一些小片段。 原核生物冈崎片段长：原核生物冈崎片段长： 真

19、核生物冈崎片段长：真核生物冈崎片段长：半不连续复制半不连续复制：DNA 两条链的复制方式不一样。两条链的复制方式不一样。 一条链连续复制，另一条链不连续复制一条链连续复制，另一条链不连续复制 半不连续复制。半不连续复制。前导链前导链：以：以 3 5链为模板合成的链叫前导链链为模板合成的链叫前导链 或领先链，该链连续合成。或领先链，该链连续合成。滞后链滞后链：以：以 5 3链为模板合成的链叫滞后链链为模板合成的链叫滞后链 或后续链，该链不连续合成。或后续链，该链不连续合成。、复制过程、复制过程 复制过程：起始、延长和终止三个阶段复制过程：起始、延长和终止三个阶段、起始、起始 特定的起始位点：原核

20、生物特定的起始位点：原核生物一个；真核一个；真核 生物生物多个。靠许多酶和蛋白因子共同多个。靠许多酶和蛋白因子共同。 E.coli 复制起点成串排列的重复序列复制起点成串排列的重复序列Dna G 由解旋蛋白和解链蛋白催化，由解旋蛋白和解链蛋白催化，（复制眼或复制泡）（复制眼或复制泡）（引物合成酶）（引物合成酶）（解螺旋酶）（解螺旋酶）（识别起点）（识别起点）（DNA结结合蛋白）合蛋白）（帮助（帮助DnaB结合于起点）结合于起点） ATP拓扑异构酶拓扑异构酶。 实验中发现，合成冈崎片段时，底物中既有实验中发现，合成冈崎片段时，底物中既有dNTP，也有，也有NTP。 噬菌体噬菌体M13感染细菌后，

21、感染细菌后，DNA合成的启动合成的启动可被利福平抑制。可被利福平抑制。 新合成新合成DNA链的链的 5 端以共价键连着一小段端以共价键连着一小段RNA。 在前引发复合物存在的条件下，引物合成酶在前引发复合物存在的条件下，引物合成酶或或RNA聚合酶即可催化引物的合成：以聚合酶即可催化引物的合成：以DNA为为模板，以四种模板，以四种NTP为底物，需要为底物，需要Mg2+、合成方、合成方向向53。E.coli 的引物合成酶为的引物合成酶为Dna G蛋白蛋白 引物长度：几个至十几个核苷酸或更多。引物长度：几个至十几个核苷酸或更多。、延长、延长 由由 DNA 聚合酶聚合酶发挥发挥 5 3的聚合功能，的聚

22、合功能，在在RNA引物的引物的 3- -OH端逐个添加脱氧核苷酸。端逐个添加脱氧核苷酸。前导链和滞后链同时合成，前者持续合成，后前导链和滞后链同时合成，前者持续合成，后者分段合成。者分段合成。、终止、终止 切除引物、填补缺口（切除引物、填补缺口（gap）。边切边补，）。边切边补，由由 DNA 聚合酶聚合酶发挥发挥 5 3外切酶的功能及外切酶的功能及 5 3聚合酶的功能来完成。聚合酶的功能来完成。 最后由最后由 DNA 连接酶将各个冈崎片段连接连接酶将各个冈崎片段连接成完整的成完整的 DNA 链。链。、复制的真实性（忠实性）、复制的真实性（忠实性）、DNA聚合酶的选择作用和校对功能：聚合酶的选择

23、作用和校对功能： 第一重校对：按碱基配对原则选择核苷酸第一重校对：按碱基配对原则选择核苷酸 第二重校对：第二重校对： 3 5外切酶的校对功能外切酶的校对功能、引物合成的作用：、引物合成的作用： DNA聚合的起始阶段，聚合的起始阶段，5末端通常不稳定，末端通常不稳定，此时合成此时合成RNA引物，虽然出现错配的可能性大，引物，虽然出现错配的可能性大，但在完成引物功能后就被切除，代之以高保真的但在完成引物功能后就被切除，代之以高保真的DNA链。链。5、真核生物、真核生物 DNA 的复制的复制 真核生物真核生物 DNA 与组蛋白构成核小体，以染色质与组蛋白构成核小体，以染色质形式存在于细胞核中。其复制

24、大致过程与形式存在于细胞核中。其复制大致过程与E.coli 相似：相似： 复制方式：半保留复制复制方式：半保留复制 具体复制过程：半不连续复制具体复制过程：半不连续复制 聚合反应：由聚合反应：由 DNA 聚合酶催化（聚合酶催化（ Mg2+、模板、引、模板、引 物、物、dNTP、聚合方向：、聚合方向：5 3） 复制过程也需各种解链蛋白和解旋蛋白的参与、复制过程也需各种解链蛋白和解旋蛋白的参与、RNA引物引物与原核生物与原核生物 DNA 复制的不同之处：复制的不同之处： 、真核生物的复制起始点、真核生物的复制起始点 有多个复制起始点，同时进行双向复制。有多个复制起始点，同时进行双向复制。 E.co

25、li 每个复制叉移动速度为每个复制叉移动速度为 50 000 bpmin 哺乳动物复制叉移动速度为哺乳动物复制叉移动速度为1 0003 000bpmin 真核生物染色体在全部复制完成之前，不再重新真核生物染色体在全部复制完成之前，不再重新开始复制（真核生物在快速生长时，往往采用更多的开始复制（真核生物在快速生长时，往往采用更多的复制起点）；而在快速生长的原核生物中，起点可以复制起点）；而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。连续发动复制。DNA聚合聚合酶酶 （）DNA聚合聚合酶酶 （M）DNA聚合聚合酶酶（）定位定位细胞核细胞核细胞核细胞核线粒体线粒体细胞核细胞核细胞核细胞核亚基数目亚

26、基数目41221外切酶活性外切酶活性无无无无3 5外切酶外切酶3 5外切酶外切酶3 5外切酶外切酶引物合成酶活引物合成酶活性性有有无无无无无无无无持续合成能力持续合成能力中等中等高高高高有有PCNA时高时高高高抑制剂抑制剂蚜肠霉素蚜肠霉素双脱氧双脱氧TTP 双脱氧双脱氧TTP蚜肠霉素蚜肠霉素蚜肠霉素蚜肠霉素功能功能修复修复线粒体线粒体DNA复制复制修复、填修复、填补缺口补缺口PCNA：增殖细胞核抗原，相当于：增殖细胞核抗原，相当于 E.coli DNA聚合酶聚合酶的的 亚基（亚基（夹子）夹子） RP-A相当于原核的相当于原核的SSB蛋白；蛋白；RF-C相当于原核的相当于原核的 复合物复合物、真

27、核生物的、真核生物的 DNA 聚合酶聚合酶、真核生物的冈崎片段和引物长、真核生物的冈崎片段和引物长 冈崎片段：冈崎片段：100200 个碱基，引物：约个碱基，引物：约 10 个碱基个碱基、真核生物、真核生物DNA复制具复杂的调控机制复制具复杂的调控机制（6）端粒）端粒DNA复制复制5、DNA 的损伤修复的损伤修复最多见的是：最多见的是：T T、DNA 损伤损伤 在一些因素的影响在一些因素的影响下，下，DNA 正常的双螺旋正常的双螺旋结构造到破坏，使其功结构造到破坏，使其功能受到影响，从而引起能受到影响，从而引起生物突变，甚至导致死生物突变，甚至导致死亡亡 DNA 损伤的原因损伤的原因、物理因素

28、：紫外线、物理因素：紫外线、 电离辐射、各种放电离辐射、各种放 射性射线射性射线、化学因素：、化学因素： 烷基化试剂烷基化试剂 化学化学 诱变剂诱变剂 亚硝酸类化亚硝酸类化 合物合物、生物因素：黄曲霉、生物因素：黄曲霉 素等素等（造成（造成 AP 位点）位点）、损伤修复、损伤修复 在一定条件下，生物机体能使其在一定条件下，生物机体能使其 DNA 的损的损伤得到修复，这就叫伤得到修复，这就叫 ，这是生，这是生物在长期进化过程中获得的一种保护功能。物在长期进化过程中获得的一种保护功能。 细胞对细胞对 DNA 损伤的修复系统有五种：直接损伤的修复系统有五种：直接修复、切除修复、重组修复、错配修复和易

29、错修复、切除修复、重组修复、错配修复和易错修复。修复。、直接修复（光复活修复）、直接修复（光复活修复） 机制：可见光（最有效波长机制：可见光（最有效波长400nm）激活）激活了了，它能分解由于紫外线照射所形成，它能分解由于紫外线照射所形成的嘧啶二聚体。的嘧啶二聚体。、切除修复（暗修复）、切除修复（暗修复） 所谓切除修复，就是在一系列酶的作用下，所谓切除修复，就是在一系列酶的作用下，切除损伤部位而代之以正常的结构。切除修复切除损伤部位而代之以正常的结构。切除修复可对多种损伤进行修复。可对多种损伤进行修复。 切除修复的方式：切除修复的方式： 先切后补与先补后切。先切后补与先补后切。 切除修复包括两

30、个过程：一是由细胞内特切除修复包括两个过程：一是由细胞内特异的酶找到异的酶找到DNA的损伤部位，切除含有损伤结的损伤部位，切除含有损伤结构的核酸链；二是修复合成并连接。构的核酸链；二是修复合成并连接。 原核生物担负损伤修复的主要酶：原核生物担负损伤修复的主要酶：DNA聚合酶聚合酶 真核生物承担损伤修复的主要酶：真核生物承担损伤修复的主要酶：DNA聚合酶聚合酶 和和DNA聚合酶聚合酶 ：短片段修复、长片短片段修复、长片段修复段修复 细胞切除修复系统和癌症的关系：细胞切除修复系统和癌症的关系： ：患者皮肤缺乏与核苷患者皮肤缺乏与核苷酸切除修复有关的酶，对紫外线引起的酸切除修复有关的酶，对紫外线引起

31、的DNA损伤不能修复。因此切除修复系统的损伤不能修复。因此切除修复系统的障碍可能是引起癌症的一个原因。障碍可能是引起癌症的一个原因。 在某些情况下无法为修复提供正确的模在某些情况下无法为修复提供正确的模板，复制叉遇到未修复的损伤链，正常的复板，复制叉遇到未修复的损伤链，正常的复制过程受阻，此时将进行制过程受阻，此时将进行或易错修或易错修复（暗修复）。复（暗修复）。AABBBBAAaaabbb6、细菌的限制、细菌的限制- -修饰系统修饰系统 该系统包括二类酶活性：修饰甲基化酶和该系统包括二类酶活性：修饰甲基化酶和限制性内切酶。限制性内切酶。 类型类型酶：酶：多亚基双功能酶，对多亚基双功能酶，对D

32、NA的甲的甲基化和切割由同一酶完成。基化和切割由同一酶完成。 类型类型酶：酶：两个亚基双功能酶，两个亚基双功能酶，M亚基负亚基负责识别与修饰，责识别与修饰，R亚基负责切割。亚基负责切割。 类型类型酶：酶：最重要、应用最多的修饰最重要、应用最多的修饰-限限制系统，其修饰、限制活性由分开的两个酶来制系统，其修饰、限制活性由分开的两个酶来完成。完成。、限制性内切酶、限制性内切酶 、属于核酸内切酶，作用于双链、属于核酸内切酶，作用于双链 DNA。 ds DNA 5- G A A T T C - 3 3- C T T A A G - 5、识别位点具特殊核苷酸序列、识别位点具特殊核苷酸序列 一般由一般由4

33、6个核苷酸组成，呈回文结个核苷酸组成，呈回文结构（构（180旋转对称结构或叫二元对称结构）旋转对称结构或叫二元对称结构） Eco R的识别序列的识别序列、切口、切口 齐头切口：产生平头末端齐头切口：产生平头末端 交错切口：产生粘性末端交错切口：产生粘性末端 粘性末端处，碱基相互配对，在一定条件粘性末端处，碱基相互配对，在一定条件下，能重新配对组成下，能重新配对组成 dsDNA ，在基因工程中，在基因工程中，粘性末端具有重要作用。粘性末端具有重要作用。 5- G A A T T C - 3 3- C T T A A G - 5MeMe、修饰甲基化酶、修饰甲基化酶 ds DNA 修饰甲基化酶与限制

34、性内切酶的识别位点相同。修饰甲基化酶与限制性内切酶的识别位点相同。其作用：将其中某一碱基甲基化，使该序列不被限其作用：将其中某一碱基甲基化，使该序列不被限制性内切酶识别。制性内切酶识别。 Eco R的识别序列的识别序列 修饰甲基化酶识别同一序列修饰甲基化酶识别同一序列 甲基化酶作用时甲基的供体：甲基化酶作用时甲基的供体：S腺苷甲硫腺苷甲硫氨酸，甲基的受体：氨酸，甲基的受体：DNA 分子上的分子上的 A 或或 C。 限制限制-修饰系统仅在细菌中发现，其生物学修饰系统仅在细菌中发现，其生物学意义：意义：在基因工程中：限制性在基因工程中：限制性内切酶可作为切割内切酶可作为切割DNA分子的手术刀，可制

35、作分子的手术刀，可制作DNA限制酶谱，分离限制片段，进行限制酶谱，分离限制片段，进行 DNA体外体外重组等，是十分有用的工具酶。重组等，是十分有用的工具酶。 1975 年，限制性内切酶的发现者：年，限制性内切酶的发现者：Smith 获诺贝尔奖。获诺贝尔奖。7、基因工程与、基因工程与 DNA 克隆克隆 对携带遗传信息的分子进行设计对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。其核心是构建重组其核心是构建重组 DNA。 将将 DNA 的限制酶切片插入克隆的限制酶切片插入克隆载体，导入宿主细胞，经过无性繁殖，以获得相载体，导入宿主

36、细胞，经过无性繁殖，以获得相同同 DNA 扩增分子的过程。扩增分子的过程。 也叫分子克隆。也叫分子克隆。 将外源将外源 DNA 带入宿主细胞并进带入宿主细胞并进行复制的运载工具。通常由质粒、病毒或一段染行复制的运载工具。通常由质粒、病毒或一段染色体色体 DNA 经改造而成。经改造而成。该质粒带有给定的该质粒带有给定的 DNA 片段（具抗药片段（具抗药性）性）含有带抗药性质粒含有带抗药性质粒的细菌能够生长的细菌能够生长鉴定并扩大培养鉴定并扩大培养纯化质粒纯化质粒 DNA 通过在细菌中生长可扩增百万以上，当细菌通过在细菌中生长可扩增百万以上，当细菌增殖期结束后，分离纯化杂交的质粒增殖期结束后，分离

37、纯化杂交的质粒 DNA ，并，并用同一限制酶进行酶切，即可得到原来的用同一限制酶进行酶切，即可得到原来的 DNA 片段的拷贝。片段的拷贝。8、聚合酶链式反应（、聚合酶链式反应（PCR）技术与）技术与 DNA 扩增扩增 聚合酶链式反应：聚合酶链式反应：DNA的体外酶促扩增，也的体外酶促扩增，也叫无细胞分子克隆法。叫无细胞分子克隆法。 PCR技术中每一循环均包括三阶段反应：技术中每一循环均包括三阶段反应：（两条链分开）（两条链分开）（模板（模板- -引物二者碱基配对）引物二者碱基配对）（DNA聚合酶以聚合酶以 4 种种 dNTP 为底物，在为底物，在引物引导下合成与模板互补的引物引导下合成与模板互

38、补的DNA）。重复此过）。重复此过程，程，DNA 以指数方式扩增。以指数方式扩增。二、二、RNA的生物合成（转录）和加工的生物合成（转录）和加工 也叫也叫 DNA 指导下的指导下的 RNA 合成，即以合成，即以 DNA 为模板，在为模板，在 RNA 聚合酶的催化下，合成聚合酶的催化下，合成 RNA 的过程。的过程。1、原核生物、原核生物 RNA 的合成的合成、原核生物的、原核生物的 RNA 聚合酶聚合酶 1960年前后年前后 RNA 聚合酶，该酶也叫依赖聚合酶，该酶也叫依赖于于 DNA 的的 RNA 聚合酶，或叫聚合酶，或叫 DNA 指导下的指导下的 RNA 聚合酶。聚合酶。(n1+n2+n3

39、+n4)PPi AMPn1+ CMPn4 UMTPn3 GMPn2RNA Pol2+Mgn2GTPn3UTPn4CTPDNA+n1ATP2+or MnRNA 聚合酶催化反应的条件：聚合酶催化反应的条件： 以以 4 种种 NTP 为底物、需要适当的为底物、需要适当的 DNA 链链为模板、需要二价金属离子（为模板、需要二价金属离子（Mg2+ 或或 Mn2+），），聚合反应方向：聚合反应方向：5 3。 RNA 聚合酶可以启动新链的合成；且无外聚合酶可以启动新链的合成；且无外切酶活性，故无校正与修复功能。切酶活性，故无校正与修复功能。 在催化聚合反应时：在催化聚合反应时：RNA 聚合酶以双链聚合酶以双

40、链 DNA 为模板时的活性要大于单链为模板时的活性要大于单链 DNA。、转录的不对称性、转录的不对称性 在体内，在体内，DNA 两条链中仅有一条可用于转两条链中仅有一条可用于转录，或者某些区域以这条链转录，另一些区域录，或者某些区域以这条链转录，另一些区域以另一条链转录，这就叫以另一条链转录，这就叫转录的不对称性转录的不对称性。 用于转录的链用于转录的链模板链（负（）链、非模板链（负（）链、非编码链、反义链），与模板链对应的链为编码链编码链、反义链），与模板链对应的链为编码链（正（正（+）链、有义链）。）链、有义链）。 编码链与编码链与 RNA 链碱基序列相同，仅以链碱基序列相同，仅以 U 代

41、代替替 T。编码链无转录功能，只能进行复制。但现。编码链无转录功能，只能进行复制。但现在认为：编码链对转录过程可能具有调节作用。在认为：编码链对转录过程可能具有调节作用。G、转录过程、转录过程 转录过程可人为分为四个阶段：转录过程可人为分为四个阶段：模板的识模板的识别别、转录的起始转录的起始、转录的延伸转录的延伸及及转录的终止转录的终止。 、模板的识别、模板的识别 模板链上每转录一个模板链上每转录一个RNA，就要有一个特，就要有一个特殊的转录起始位点即殊的转录起始位点即启动子启动子。 RNA 聚合酶识别、结合并起始转录的一段聚合酶识别、结合并起始转录的一段 DNA 序列就叫序列就叫。 上游上游

42、 10 下游下游 35（识别位点）（识别位点）（紧密结合位点）（紧密结合位点）+1（起始转录位点）（起始转录位点） 、转录的起始、转录的起始 在转录泡上，开始聚合反应，合成在转录泡上，开始聚合反应，合成 RNA 链最链最初的初的 29 个核苷酸。第一个核苷酸往往是带有三个核苷酸。第一个核苷酸往往是带有三个磷酸基的鸟苷或腺苷（个磷酸基的鸟苷或腺苷（pppG 或或 pppA），随后），随后 因子脱离核心酶，起始阶段结束。因子脱离核心酶，起始阶段结束。pppG+ pppNpppGpN-OH、转录的延长、转录的延长 因子的脱落，使核心酶可以离开启动因子的脱落，使核心酶可以离开启动子沿着子沿着 DNA

43、分子向前移动，解链区也跟着移分子向前移动，解链区也跟着移动，动，RNA 链得以不断延长。链得以不断延长。RNA 链延伸方向：链延伸方向：5 3，延伸速度：，延伸速度：2550 核苷酸秒。核苷酸秒。 RNA 聚合酶能够局部解开聚合酶能够局部解开 DNA 的两条链，并以的两条链，并以其中的一条链为模板，在其上合成出互补链。其中的一条链为模板，在其上合成出互补链。、转录的终止、转录的终止 DNA 分子上终止转录的信号分子上终止转录的信号特殊的特殊的核苷酸序列叫核苷酸序列叫。 在在 Nus A 因子的帮助下，核心酶识别转因子的帮助下，核心酶识别转录终止信号，停止录终止信号，停止 RNA 链的延长。酶与

44、链的延长。酶与 RNA 链离开模板，链离开模板，DNA 恢复双螺旋结构。恢复双螺旋结构。4、RNA 生物合成的抑制剂生物合成的抑制剂、嘌呤和嘧啶类似物、嘌呤和嘧啶类似物 例如：例如： 6-巯基嘌呤巯基嘌呤 5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶 NNNNSHNNOOF 作用：酶的抑制剂；或渗入核酸分子。作用：酶的抑制剂；或渗入核酸分子。、DNA 模板功能的抑制物模板功能的抑制物 一些化合物能够与一些化合物能够与 DNA 结合，使之失去模板功结合，使之失去模板功能，从而抑制其复制和转录能，从而抑制其复制和转录、烷基化试剂、烷基化试剂、放线菌素、放线菌素 有抗菌和抗癌有抗菌和抗癌作用。作用。 放线菌素放线菌素 D能

45、能与与 DNA 形成非共价形成非共价的复合物，是原核的复合物，是原核及真核及真核 RNA 聚合酶聚合酶的专一性抑制剂。的专一性抑制剂。、嵌入染料、嵌入染料 具扁平芳香族发色团，可插入到具扁平芳香族发色团，可插入到 dsDNA 相相邻碱基对之间，是邻碱基对之间，是 RNA 聚合酶的抑制剂。并能聚合酶的抑制剂。并能在插入后使在插入后使 DNA 复制时缺失或增添一个核苷酸，复制时缺失或增添一个核苷酸，从而导致移码突变从而导致移码突变、RNA 聚合酶的抑制物聚合酶的抑制物 利福平（利福霉利福平（利福霉素素B衍生物）及利链菌衍生物）及利链菌素均是细菌素均是细菌 RNA 聚合聚合酶的抑制剂，能与细酶的抑制

46、剂，能与细菌菌 RNA 聚合酶的聚合酶的 - -亚亚基结合，从而抑制转基结合，从而抑制转录过程中链的延长反录过程中链的延长反应。应。 -鹅膏蕈碱是从毒蘑菇中提取出来的一种鹅膏蕈碱是从毒蘑菇中提取出来的一种八肽化合物，它是真核生物八肽化合物，它是真核生物 RNA 聚合酶的抑聚合酶的抑制剂。主要通过抑制真核制剂。主要通过抑制真核 RNA 聚合酶聚合酶而阻而阻断真核生物蛋白质的合成。断真核生物蛋白质的合成。5、转录产物的加工、转录产物的加工 由由 RNA 聚合酶刚转录出来的初级转录产物，聚合酶刚转录出来的初级转录产物，通常不具生物活性，叫通常不具生物活性，叫 RNA 前体前体。RNA 前体经前体经一

47、系列的变化成为成熟分子的过程，叫一系列的变化成为成熟分子的过程，叫 RNA 的的成熟成熟或或转录后的加工转录后的加工。、rRNA 前体的加工前体的加工、原核生物、原核生物 rRNA 前体的加工前体的加工 原核生物原核生物 rRNA 前体为前体为 30S rRNA，内含，内含 5S、23S 及及 16S rRNA以及一个或几个以及一个或几个 tRNA，需进，需进行复杂的剪接加工。行复杂的剪接加工。（主要在核糖上）（主要在核糖上）、真核生物、真核生物 rRNA 前体的加工前体的加工 哺乳动物哺乳动物 rRNA 前体为前体为 45S rRNA，内含，内含 5.8S、28S 及及 18S rRNA。其

48、加工过程类似于原核生物。其加工过程类似于原核生物。 rRNA 前体合成、加工及装配成核糖体的场所在前体合成、加工及装配成核糖体的场所在核仁。核仁。 真核生物真核生物5S rRNA的基因也是排列成行，由的基因也是排列成行，由 RNA聚合酶聚合酶转录，经适当加工后与转录，经适当加工后与28S及及18S rRNA及相关蛋白质组装成核糖体大亚基；及相关蛋白质组装成核糖体大亚基；18S rRNA与相关蛋白质组装成核糖体小亚基，再通过核与相关蛋白质组装成核糖体小亚基，再通过核孔转移到细胞质参与核糖体循环。孔转移到细胞质参与核糖体循环。（主要在核糖上）（主要在核糖上）、tRNA 前体的加工前体的加工、原核生

49、物、原核生物 tRNA 前体的加工前体的加工 由核酸内切酶在由核酸内切酶在 tRNA 的两端切断的两端切断 由核酸外切酶从由核酸外切酶从 3端逐个切去附加的序端逐个切去附加的序列，进行修剪列，进行修剪 在在 tRNA 的的 3端加上端加上 - -C- -C- -AOH 序列序列 核苷酸的修饰与异构化核苷酸的修饰与异构化内切酶内切酶5端成熟酶端成熟酶内切酶内切酶外切酶外切酶3端成熟酶端成熟酶I、真核生物、真核生物 tRNA 前体的加工前体的加工 与原核生物类似的与原核生物类似的 RNase P 切除切除 5端的附端的附加序列，加序列，3端附加序列的切除则需多种内切酶端附加序列的切除则需多种内切酶

50、和外切酶的共同作用。和外切酶的共同作用。 真核生物真核生物 tRNA 前体前体 3端不含端不含 CCA 序列，序列，所以也需加工上去。所以也需加工上去。 核苷酸的修饰与异构化核苷酸的修饰与异构化 有居间序列（内含子）的要将该序列切除有居间序列（内含子）的要将该序列切除、mRNA 前体（前体（hnRNA）的加工）的加工 原核生物原核生物 mRNA 一般不需加工，即可直接一般不需加工，即可直接作为模板指导蛋白质的合成。作为模板指导蛋白质的合成。 真核生物的真核生物的mRNA为单顺反子。大多数蛋为单顺反子。大多数蛋白质基因存在居间序列（内含子），且由于真白质基因存在居间序列（内含子），且由于真核生物

51、成熟核生物成熟 mRNA 结构上的特点，故真核生物结构上的特点，故真核生物 mRNA 前体具复杂的转录后加工。前体具复杂的转录后加工。 真核生物真核生物mRNA 前体的一般加工过程：前体的一般加工过程：、 5端形成特殊的帽子结构端形成特殊的帽子结构 m7G5ppp 5N1mpN2p、3末端的产生和多聚腺苷酸化末端的产生和多聚腺苷酸化、mRNA 内部的甲基化内部的甲基化 主要是主要是 N6 甲基腺嘌呤（甲基腺嘌呤（m6A）、mRNA 前体的剪接前体的剪接 切除内含子，将外显子准确地连接起来切除内含子，将外显子准确地连接起来 这是基因表达的重要环节。这是基因表达的重要环节。 剪接需在拼接体形成之后

52、才能进行，剪接需在拼接体形成之后才能进行，snRNA（U族族 RNA）及几十种蛋白质参与此过程）及几十种蛋白质参与此过程6、RNA 复制复制 RNA 复制：复制：RNA 指导下的指导下的 RNA 合成。合成。 RNA 病毒：病毒： 一般一般 RNA病毒：以释放毒病毒：以释放毒素的形式使宿主得病，在宿主体内增殖到一定程素的形式使宿主得病，在宿主体内增殖到一定程度后，使宿主细胞破裂死亡；度后，使宿主细胞破裂死亡；致癌致癌 RNA 病毒：病毒：能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤或其他能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤或其他肿瘤的病毒。这类病毒浸染细胞后可使细胞发生肿瘤的病毒。这类病毒浸染细胞后可使细胞发生恶性转化。恶性转化。 RNA 复制酶催化反应的条件：复制酶催化反应的条件： 以以 4 种种 NTP 为底物、以为底物、以 RNA 链为模板、需链为模板、需要二价金属离子（要二价金属离子（Mg2+ 或或 Mn2+），聚合反应方），聚合反应方向：向：5 3。 RNA 复制酶也叫复制酶也叫