单克隆抗体制备2014

1、 单克隆抗体制备技术单克隆抗体制备技术 monoclonal antiboddy productionmonoclonal antiboddy production广州医科大学金域检验学院广州医科大学金域检验学院 徐霞徐霞本章内容本章内容单克隆抗体概念、特性、与多克隆抗体的单克隆抗体概念、特性、与多克隆抗体的异同点？异同点？杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤细胞的克隆方法杂交瘤细胞的克隆方法 单克隆抗体的制备流程和应用单克隆抗体的制备流程和应用概念概念多克隆抗体（多克隆抗体（PcAbPcAb）：针对抗原不同表位）：针对抗原不同表位的多个的多个B B淋巴细胞克隆产生的混合抗体淋巴细

2、胞克隆产生的混合抗体单克隆抗体（单克隆抗体（McAbMcAb）：只针对抗原单一表）：只针对抗原单一表位的位的B B淋巴细胞克隆产生的同源抗体淋巴细胞克隆产生的同源抗体为何要使用单克隆抗体？为何要使用单克隆抗体？一个抗原分子可能含有许多抗原表位一个抗原分子可能含有许多抗原表位一个一个B B细胞只会生产一种抗体细胞只会生产一种抗体传统抗血清对相似抗原会有交叉反应性传统抗血清对相似抗原会有交叉反应性一个抗原分子上常有许多一个抗原分子上常有许多表位表位抗原分子上可以诱导出抗抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段，称为体的部位或片段，称为eptope eptope 、antigenic antigenic

3、 determinantdeterminant；一个抗原；一个抗原分子上通常都有许多分子上通常都有许多eptopeeptope ，每个，每个eptopeeptope至至少都可诱生出一种抗体；少都可诱生出一种抗体；因此在传统抗血清中，都因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，含有许多种不同的抗体，分别针对这些不同的分别针对这些不同的eptopeeptope。一个一个B B细胞只会生产一种抗体细胞只会生产一种抗体 血清中的每一种抗体血清中的每一种抗体是由单一种是由单一种 B B 细胞细胞 所分泌产生，若能把所分泌产生，若能把此此 B B 细胞由脾脏中挑细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细出来，单独

4、培养成细胞株，则可获得单一胞株，则可获得单一种类的抗体，只会对种类的抗体，只会对一种一种 eptopeeptope反应。反应。 大量培养此细胞株，大量培养此细胞株，即可有品质一定、纯即可有品质一定、纯度均一的抗体，即度均一的抗体，即单单克隆抗体克隆抗体。抗血清对相似抗原会有交叉反应性抗血清对相似抗原会有交叉反应性对于分子构造相似的抗对于分子构造相似的抗原，由于它们含有共同原，由于它们含有共同或相似的或相似的eptopeeptope ，所产，所产生的抗血清对这两种相生的抗血清对这两种相似的抗原都会产生反应，似的抗原都会产生反应，称为称为交叉反应性交叉反应性。 同时同时又由于免疫动物的个体又由于免

5、疫动物的个体差异，对抗原的反应也差异，对抗原的反应也有相当的差异，以致无有相当的差异，以致无法准确控制所得到每批法准确控制所得到每批抗血清抗血清 效价效价的高低的高低抗血清和单克隆抗体制备抗血清和单克隆抗体制备 B B细胞无法在培养基中生长细胞无法在培养基中生长 B B细胞不易在培细胞不易在培养基中生長，养基中生長，虽然有人一直虽然有人一直努力，想找出努力，想找出在体外培养脾在体外培养脾脏细胞的条件，脏细胞的条件，但结果均不甚但结果均不甚理想。理想。 ( (見見 图图 中央的中央的 4 4 号号B B 细胞细胞，X X 表示表示无法培养无法培养) )肿瘤细胞可在培养基中永久生长肿瘤细胞可在培养

6、基中永久生长 肿瘤细胞可在肿瘤细胞可在培养基中永久培养基中永久生长：若把瘤生长：若把瘤细胞永久生长细胞永久生长的特性，利用的特性，利用细胞融合技术细胞融合技术导入可生产抗导入可生产抗体的体的 B B 细胞细胞 中，则得到可中，则得到可在培养基中永在培养基中永久生长的久生长的 B B 细胞株，即杂细胞株，即杂交瘤细胞株。交瘤细胞株。 1975年年KoehlerKoehler和和MilsteinMilstein在在NatureNature杂志联名发表题为杂志联名发表题为“分泌预定特异性抗体的融合细胞持续培养分泌预定特异性抗体的融合细胞持续培养“的论文，宣的论文，宣告单克隆抗体的诞生，该成果获告单克

7、隆抗体的诞生，该成果获19841984年诺贝尔医学奖和生年诺贝尔医学奖和生理奖理奖. . 杂交瘤技术制备单克隆抗体杂交瘤技术制备单克隆抗体杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤技术是将能够产生抗体，但在体外不能进行杂交瘤技术是将能够产生抗体，但在体外不能进行无限繁殖的无限繁殖的B B淋巴细胞淋巴细胞与能在体外进行无限繁殖，与能在体外进行无限繁殖，但不能产生抗体的但不能产生抗体的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞。融合成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性：这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性：既能够既能够分泌特异性的抗体，又能够在体外长期繁殖分泌特异性的抗体，又能够在体

8、外长期繁殖。杂交。杂交瘤细胞经过筛选、克隆化培养后成为单个细胞克隆，瘤细胞经过筛选、克隆化培养后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。分泌的抗体即为单克隆抗体。 单克隆抗体制备流程图单克隆抗体制备流程图 亲本细胞的选择与制备亲本细胞的选择与制备细胞株稳定，易传代培养；细胞株稳定，易传代培养；细胞株本身不产生细胞株本身不产生IgIg是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转换酶糖转换酶 缺陷株缺陷株 (hypoxanthine-guanine (hypoxanthine-guanine phos phoribosyl phos phoribosyl transferase ,tran

9、sferase ,HGPRTHGPRT) )最常用的骨髓瘤细胞是最常用的骨髓瘤细胞是NS-1NS-1和和SP2/0SP2/0细胞株细胞株骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 (NS-1)(NS-1)骨髓瘤细胞需定期用骨髓瘤细胞需定期用8-8-氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤(8-AG)(8-AG)处理处理亲本细胞的选择与制备亲本细胞的选择与制备免疫脾细胞免疫脾细胞：是经过抗原诱导活化的免疫细胞，是经过抗原诱导活化的免疫细胞，具有分泌抗体的能力具有分泌抗体的能力8-128-12周龄周龄BALB/cBALB/c小鼠小鼠 先以先以 目标抗原目标抗原( (如菌体如菌体) ) 免疫免疫，抗，抗原需加原需加 佐剂佐剂(adjuvant(

10、adjuvant）注入小鼠体内注入小鼠体内慢慢释出，诱使慢慢释出，诱使 B B 细胞成熟增殖并生产抗体。细胞成熟增殖并生产抗体。 试采血试采血 确定有抗体产生后，确定有抗体产生后，即可取出即可取出 脾脏脾脏以收集以收集脾脏细胞脾脏细胞( (大多为大多为B B 细胞细胞) ) 与骨髓瘤与骨髓瘤细胞进行细胞进行 细胞融合细胞融合。 注意乳剂的生产要完全，可取小量滴入水中，注意乳剂的生产要完全，可取小量滴入水中，震动后应该震动后应该不会散去。不会散去。 有人打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。有人打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。 但除非抗原来但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍采用传统方法，因免疫反应

11、源困难或有其它目的，我们仍采用传统方法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应是最可靠的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应是最可靠的。的。 细胞融合小鼠脾细胞 B B 与NS-1 细胞 N N 以 PEGPEG 进行融合，操作在 2 min 內完成 。PEGPEG可导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合。 常见的几种融合形式常见的几种融合形式细胞细胞DNADNA合成途经合成途经HAT选择培养基三种关键成分三种关键成分： 次黄嘌呤（次黄嘌呤（hypoxanthine,Hhypoxanthine,H） 氨基蝶呤（氨基蝶呤（aminopterin,Aamin

12、opterin,A） 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（thymidine thymidine ，T T）是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途径设计的用于筛选杂酸的生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞的特殊培养基。交瘤细胞的特殊培养基。 叶酸参与叶酸参与DNADNA合成过程，而氨基蝶呤是叶酸的拮抗合成过程，而氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，能阻断该合成途径。剂，能阻断该合成途径。 HATHAT培养基中含有叶酸拮抗剂培养基中含有叶酸拮抗剂- -氨基蝶呤，故所有氨基蝶呤，故所有细胞细胞DNADNA合成的主要途径均被阻断，只能通过替代合成的主要途径均被阻断，只能通过替代途径合成。

13、途径合成。杂交瘤细胞从脾细胞中获得杂交瘤细胞从脾细胞中获得HGPRTHGPRT，同时又继承了，同时又继承了骨髓瘤细胞长期生长繁殖的特性，能够在骨髓瘤细胞长期生长繁殖的特性，能够在HATHAT培养培养基中得以生存而被筛选出来。基中得以生存而被筛选出来。核苷酸从头合成途径核苷酸从头合成途径（de novo synthesisde novo synthesis）核苷酸核苷酸氨基碟呤氨基碟呤（A A）HATHAT核苷酸补救合成途径核苷酸补救合成途径（salvage synthesissalvage synthesis）次黄嘌呤次黄嘌呤（H H）胸腺嘧胸腺嘧啶核苷啶核苷（T T）DNADNA筛选方法筛选

14、方法初步筛选初步筛选： 融合后马上以融合后马上以 HAT HAT 培养，能培养，能活下来的都是活下来的都是 B B 细胞与细胞与 NS-1 NS-1 的正确融的正确融合细胞，但此时细胞的合细胞，但此时细胞的遗传遗传背景尚未十分背景尚未十分稳定。稳定。 筛选特异性抗体筛选特异性抗体： 并非所有并非所有 B B 细胞都会细胞都会产生我们所要的抗体，小鼠原先就存在许产生我们所要的抗体，小鼠原先就存在许多多 B B 细胞株对抗一般疾病；因此要用细胞株对抗一般疾病；因此要用 酶酶联联免疫分析法免疫分析法 （ELISAELISA）挑出特异性抗体）挑出特异性抗体阳性杂交瘤细胞的克隆化阳性杂交瘤细胞的克隆化克

15、隆化克隆化 从抗体阳性孔中分离出单个细胞从抗体阳性孔中分离出单个细胞进行培养，使之繁殖成单一细胞集落的过进行培养，使之繁殖成单一细胞集落的过程。程。有限稀释法有限稀释法：最常用的方法：最常用的方法显微操作法显微操作法荧光激活细胞分选法荧光激活细胞分选法软琼脂平板法软琼脂平板法 有限稀释法有限稀释法计数计数10103 3/ml/ml10102 2/ml/ml10/ml10/ml0.5-2/0.5-2/孔孔将阳性孔细胞株稀将阳性孔细胞株稀释，重新平分到释，重新平分到 96 96 孔细胞培养板孔细胞培养板中，以计算使得每中，以计算使得每孔中只含有一个细孔中只含有一个细胞（例如胞（例如 每每 mL m

16、L 含有含有100 100 个细胞，个细胞，若只要取一个细胞若只要取一个细胞放到一个培养孔中，放到一个培养孔中，那你应该吸取多少那你应该吸取多少 mLmL？ 0.01 mL0.01 mL），），待其生长成群落后，待其生长成群落后，再次以再次以 ELISA ELISA 筛筛选特异性抗体。选特异性抗体。克隆化需至少进行克隆化需至少进行3-53-5次次阳性杂交瘤细胞的冻存目的：保证杂交瘤细胞不会因污染或过多目的：保证杂交瘤细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。传代变异丢失染色体而丧失功能。冻存液冻存液：10%-90%10%-90%小牛血清小牛血清+10%+10%二甲亚砜二甲亚砜（DMSO

17、DMSO），），1X101X106 6-5X10-5X106 6/0.5 mL/0.5 mL逐步降温逐步降温:-80:-800 0C C过夜过夜, ,再放入液氮再放入液氮单克隆抗体生产单克隆抗体生产小鼠体内诱生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一小鼠体内诱生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一周后把挑选出来的杂交瘤细胞打入小鼠腹部，诱周后把挑选出来的杂交瘤细胞打入小鼠腹部，诱生肿瘤，然后以生肿瘤，然后以 针头针头 收集所产生的收集所产生的 腹水腹水，通，通常可取得常可取得 15 mL 15 mL 左右；腹水中的抗体浓度非常左右；腹水中的抗体浓度非常高，每高，每 mL mL 可达数可达数 mgmg。 2)2

18、)体外增量培养法：体外增量培养法： 把杂交瘤细胞在大型培养把杂交瘤细胞在大型培养槽中培养，收集培养液上清即得抗体，但每槽中培养，收集培养液上清即得抗体，但每 mL mL 只得约数只得约数 mgmg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，一种细胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极为昂贵但价格极为昂贵 (IBS Integra Bioscience: (IBS Integra Bioscience: Integra Integra CellineCelline) )。单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的性质鉴定IgIg类型测定类型测定特异性测定特异性测定效价测定效价测定结合表位测定结合表位测定亲和力测定亲和力测定染色体分析染色体分析单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性高度特异性高度特异性高度的均一性和可重复性高度的均一性和