淋巴细胞分离、E花环

1、实验目的实验目的 掌握密度梯度离心法分离外周血淋巴细掌握密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞的的原理和方法。胞的的原理和方法。 掌握掌握E花环测定原理和判定标准花环测定原理和判定标准 熟悉熟悉E花环测定操作方法花环测定操作方法实验原理实验原理 外周血淋巴细胞分离常用方法是外周血淋巴细胞分离常用方法是聚蔗糖聚蔗糖- -泛影泛影葡胺密度梯度离心法葡胺密度梯度离心法。PBMCPBMC与血液中的其他成与血液中的其他成分存在密度差异，利用密度在分存在密度差异，利用密度在1.0771.0770.0020.002之之间，而且近于等渗的间，而且近于等渗的Ficoll-HypaqueFicoll-Hypaque混合

2、溶液混合溶液（称为淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，（称为淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。血各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；分层液的底部；PBMCPBMC密度稍低于分层液，故位密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得淋巴细胞。于分层液界面上，这样就可获得淋巴细胞。实验材料与试剂肝素（肝素（100U/100U/毫升）、毫升）、D-HanksD-Hanks液、液、 淋巴

3、细胞分离液（淋巴细胞分离液（ficollficoll）、瑞氏）、瑞氏染液染液离心机、显微镜、试管，吸管等。离心机、显微镜、试管，吸管等。实验方法与步骤1 1、采集兔静脉血，注入盛有肝素（、采集兔静脉血，注入盛有肝素（20U/ml20U/ml）的）的搪瓷缸中，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。搪瓷缸中，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。2 2、每组用吸管吸取、每组用吸管吸取2ml2ml抗凝血，加入等体积即抗凝血，加入等体积即2ml2ml的室温的室温D-HanksD-Hanks液，使血液等倍稀释。液，使血液等倍稀释。3 3、每组取已加入、每组取已加入2ml2ml淋巴细胞分离液的试管淋巴细胞分离液的试管1 1支，支

4、，将离心管倾斜将离心管倾斜4545 角，在距分层液界面上角，在距分层液界面上1cm1cm处将稀释血液沿试管壁缓慢加至分层液上面，处将稀释血液沿试管壁缓慢加至分层液上面，每管每管4ml4ml，注意保持两者界面清晰，勿使血，注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。液混入分层液内。4 4、25002500转转/ /分离心分离心20min20min，离心后，管内可分为四，离心后，管内可分为四层：上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血层：上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位混浊的灰白分层液；分层液与血浆

5、交界部位混浊的灰白色层即为淋巴细胞层。色层即为淋巴细胞层。5 5、另取、另取1 1只只10ml10ml试管，加入试管，加入6ml D-Hanks6ml D-Hanks液，用毛液，用毛细吸管轻轻插到白膜层，取吸淋巴细胞层至细吸管轻轻插到白膜层，取吸淋巴细胞层至此试管中，此试管中，15001500转转/ /分离心分离心10min10min洗涤，共洗涤，共2 2次。次。6 6、弃上清，用、弃上清，用1ml D-Hanks1ml D-Hanks定容细胞，混匀。定容细胞，混匀。7 7、用瑞氏染液染色，观察所分离细胞的形态和结、用瑞氏染液染色，观察所分离细胞的形态和结构，并画图。构，并画图。 瑞氏染色 吸

6、取吸取淋巴淋巴细胞涂片，待涂片干燥后，滴细胞涂片，待涂片干燥后，滴加瑞氏染料加瑞氏染料3-5d3-5d，铺满玻片，铺满玻片，0.5-1min0.5-1min后滴加等量的瑞氏染料缓冲液，用洗耳后滴加等量的瑞氏染料缓冲液，用洗耳球吹匀，使染料混合均匀，球吹匀，使染料混合均匀，5-10min5-10min后用后用流水冲洗，待干后镜检。流水冲洗，待干后镜检。注意事项1 1、将稀释血液加入、将稀释血液加入FicollFicoll上时动作要轻，上时动作要轻，使界面清楚，避免与使界面清楚，避免与FicollFicoll混合。混合。2 2、操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避、操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避

7、免损伤细胞活性及细胞丢失。免损伤细胞活性及细胞丢失。3 3、细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之、细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一，最适密度在室温下应为一，最适密度在室温下应为1.0771.0770.0020.002；应；应避光避光44下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用；使用中应避免细菌污染。方可使用；使用中应避免细菌污染。4 4、离心时的温度对分离效果亦有影响，温度过、离心时的温度对分离效果亦有影响，温度过低，离心时间需适当延长，淋巴细胞丢失增多；低，离心时间需适当延长，淋巴细胞丢失增多；温度过高，增加红细胞凝聚，且影响淋巴细胞温度过高，增

8、加红细胞凝聚，且影响淋巴细胞活性。离心时最适温度为活性。离心时最适温度为18-2518-25。 实验原理 正常人的正常人的T T淋巴细胞表面具有能与绵羊红淋巴细胞表面具有能与绵羊红细胞（细胞（SRBCSRBC）表面糖肽相结合的受体（）表面糖肽相结合的受体（E E受体），即受体），即CDCD2 2分子，是一种糖蛋白，分子，是一种糖蛋白， 是是T T细胞所特有的表面标志，在体外一定细胞所特有的表面标志，在体外一定条件下条件下T T细胞能直接与细胞能直接与SRBCSRBC结合，形成玫结合，形成玫瑰花样细胞团，称为瑰花样细胞团，称为E E花环。此实验即为花环。此实验即为E E玫瑰花环试验，常用于检测玫

9、瑰花环试验，常用于检测T T细胞的数细胞的数量、活性及分离量、活性及分离T T细胞。细胞。实验材料 器材：离心机、显微镜、试管、玻器材：离心机、显微镜、试管、玻片、毛细吸管、片、毛细吸管、 试剂：详见实验教材试剂：详见实验教材P248实验方法1 1、分离得到淋巴细胞，计数后，用、分离得到淋巴细胞，计数后，用HanksHanks液配成液配成1 110107 7/ml/ml细胞悬液。细胞悬液。2 2、取、取0.1ml0.1ml淋巴细胞悬液，加入淋巴细胞悬液，加入0.1ml 1%SRBC0.1ml 1%SRBC及及20l20l灭活小牛血清，混匀灭活小牛血清，混匀3737静置静置5min5min，以低

10、速以低速500rpm500rpm离心离心5min5min，然后放入，然后放入44冰箱冰箱2h2h或过夜。或过夜。3 3、取出试管，在细胞悬浮前，吸弃一半上清液，、取出试管，在细胞悬浮前，吸弃一半上清液，加入加入0.8%0.8%戊二醛溶液戊二醛溶液0.1ml0.1ml，轻轻旋转混匀，轻轻旋转混匀，置于置于44冰箱固定冰箱固定15min15min，制成湿片观察计数或，制成湿片观察计数或制成干片，经瑞氏染色后镜检，此为制成干片，经瑞氏染色后镜检，此为EtEt花环，花环，t t代表细胞总数。代表细胞总数。4 4、部分、部分T T细胞具有高度亲和力的细胞具有高度亲和力的SRBCSRBC受体，受体，当当S

11、RBCSRBC与淋巴细胞按与淋巴细胞按8:18:1混合，低速离心混合，低速离心后不经低温放置，即能迅速形成后不经低温放置，即能迅速形成E E花环，花环，称为称为EaEa花环。花环。结果与分析 凡能结合三个以上凡能结合三个以上SRBCSRBC者即为者即为E E花环阳性花环阳性细胞，计数细胞，计数200200个淋巴细胞，算出花环形个淋巴细胞，算出花环形成细胞的百分率，成细胞的百分率，EtEt花环正常值花环正常值60%-80%60%-80%。 EaEa花环正常值花环正常值25%-40%25%-40%注意事项1 1、试验用的、试验用的SRBCSRBC要新鲜，脱纤维血要新鲜，脱纤维血44保保存不超过存不超过1010天。天。2 2、