实验4 微生物菌落的观察和细菌的运动性观察

1、实验四 微生物菌落的观察和细菌的运动性观察目目 的的 要要 求求n学会观察、识别各种不同的微生物菌落的方法。学会观察、识别各种不同的微生物菌落的方法。 n掌握平板菌落计数的方法，运用所学的知识详细的掌握平板菌落计数的方法，运用所学的知识详细的描述所分离平板上的各种微生物菌落。描述所分离平板上的各种微生物菌落。n了解普通光学显微镜的构造和原理，熟悉其使用的了解普通光学显微镜的构造和原理，熟悉其使用的正确方法。正确方法。 n学习并掌握油镜的使用方法，学会用压滴法或悬滴学习并掌握油镜的使用方法，学会用压滴法或悬滴法观察细菌运动性的基本技术。法观察细菌运动性的基本技术。实实 验验 原原 理理对于一些难

2、区别的菌落还应该借助显微镜来观察其细胞形态对于一些难区别的菌落还应该借助显微镜来观察其细胞形态以进一步做出正确的判断。以进一步做出正确的判断。 1. 1. 物镜转换器物镜转换器 2. 2. 接物镜接物镜 3.3.游标卡尺游标卡尺 4. 4.载物台载物台 5.5.聚光器聚光器 6. 6. 彩虹光阑彩虹光阑 7.7.光源光源 8. 8. 镜座镜座 9. 9. 电源开关电源开关 10. 10. 光源滑动光源滑动变阻器变阻器 11. 11. 粗调螺旋粗调螺旋 12. 12. 微调螺旋微调螺旋 13. 13. 镜臂镜臂 14.14.镜筒镜筒 15.15.目镜目镜 16.16.标本移动螺旋标本移动螺旋 显

3、微镜的放大倍数和分辨率显微镜的放大倍数和分辨率 1. 放大倍数放大倍数= =接物镜放大倍数接物镜放大倍数接目镜放大倍数接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率显微镜的分辨率 是表示显微镜辨析物体（两端）两点之是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力。间距离的能力。（一）普通光学显微镜的构造（一）普通光学显微镜的构造nD：物镜分辨出物体两点间的最短距离；物镜分辨出物体两点间的最短距离； NA，数值孔径数值孔径，是物镜的参数之一是物镜的参数之一 ； ：入射光的波长入射光的波长（可见光平均可见光平均0.550.55 m m) ) n: 物镜和被检标本间介质的折射率；物镜和被检标本间介质的折射率；（

4、空气为空气为1.0，水为，水为1.33，玻璃为，玻璃为1.52，甘油为，甘油为1.47，香柏油为，香柏油为1.515。） ：镜口角镜口角（即入射角）：（即入射角）：是指从物镜光是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度径的边缘所张的角度 。n比如，肉眼所能感受的光波平均长度为比如，肉眼所能感受的光波平均长度为0.55m，假如，假如NA=0.65的接物的接物镜，它的分辨力镜，它的分辨力D=*0.55/0.65=0.42m以下的两点间的距离就分辨不以下的两点间的距离就分辨不出来了，即使使用倍数更大的接目镜使其总放大率增加也仍分辨不出，

5、出来了，即使使用倍数更大的接目镜使其总放大率增加也仍分辨不出，只有改用数值孔径更大的接物镜才行。只有改用数值孔径更大的接物镜才行。 n显微镜的分辨率可用公式表示为：显微镜的分辨率可用公式表示为：D=/2NA =/2nsin(/2 )（二）油镜的使用原理（二）油镜的使用原理n油镜，即油浸接物镜。当油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散使光线受到曲折，发生散射，射，降低了视野的照明度降低了视野的照明度。 n加入中间的介质是一层香加入中间的介质是一层香柏油（其柏油

6、（其折射率与玻片的折射率与玻片的相近相近），则几乎不发生折），则几乎不发生折射，射，增加了视野的进光量，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰从而使物象更加清晰。实实 验验 材材 料料n实验三所作的平板培养物：实验三所作的平板培养物：qA，在，在细菌细菌培养基上生长的各种菌落；培养基上生长的各种菌落；qB，在，在霉菌霉菌培养基上生长的各种菌落。培养基上生长的各种菌落。 n实验二所作的实验二所作的试管斜面试管斜面，酒精灯、接种环等。，酒精灯、接种环等。n盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。n菌种：大肠杆菌菌种：大肠杆菌E.coli，枯草杆菌，枯草杆菌B.subtili

7、s或实验三所或实验三所培养菌种培养菌种实 验 程 序（观察描述菌落特征）n运用所掌握的各种微生物菌落的特点，观察、识别、描运用所掌握的各种微生物菌落的特点，观察、识别、描述所做样品的两个平板上的所有菌落述所做样品的两个平板上的所有菌落,并将结果填入并将结果填入表表1中。中。n常用的菌落描述词语：常用的菌落描述词语：n大小：大小： 大、中、小、针尖状大、中、小、针尖状n形状：形状： 圆形、隆起、扁平、假根状、不规则状等；圆形、隆起、扁平、假根状、不规则状等；n边缘情况：边缘情况： 整齐、波形、裂叶状、锯齿状等整齐、波形、裂叶状、锯齿状等n表面情况：表面情况： 干燥、湿润、光滑、皱褶、颗粒状、龟裂

8、状干燥、湿润、光滑、皱褶、颗粒状、龟裂状等；等；表表1 平板菌落特征描述平板菌落特征描述n定义定义:根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征而设计的计数是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征而设计的计数方法，即方法，即一个菌落代表一个单细胞一个菌落代表一个单细胞。统计菌落数目，。统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。即可计算出样品中的含菌数。n此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。称活菌计数。 n对土壤中的微生物进行计数对土壤中的微生物进行计数,将结果填入表

9、将结果填入表2中。中。实实 验验 程程 序序（平板菌落计数）（平板菌落计数）表表2 土壤中微生物计数结果土壤中微生物计数结果 计数方法计数方法: 每克土壤的菌数每克土壤的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数同一稀释度几次重复的菌落平均数稀释倍数稀释倍数 计算结果时，常按下列标准从接种后的计算结果时，常按下列标准从接种后的2个或个或3个稀释度中选择一个合适个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。 （1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。 （2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿细菌、放线菌、酵母菌以每皿30300

10、个菌落为宜个菌落为宜，霉菌以每皿霉菌以每皿10100个菌落为宜。个菌落为宜。 选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。下式计算。实实 验验 程程 序序显微镜（油镜）的使用：显微镜（油镜）的使用： 1、用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2 2、打开光源，调节光亮度打开光源，调节光亮度 3、低倍镜观察：粗调、细调低倍镜观察：粗调、细调 4、依次再进行中倍、高倍观察依次再进行中倍、高倍观察 5、油镜观察：油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央高

11、倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 6 6、换片：另换新片，必须从第三条开始操作。换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7、用后复原：用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。的二甲苯，后将镜体全部复原。一、一、结合标本片的观察，掌握油镜的使用方法；观察各类

12、结合标本片的观察，掌握油镜的使用方法；观察各类微生物染色片，边观察边绘图。微生物染色片，边观察边绘图。二、细菌运动性的观察（二、细菌运动性的观察（压滴法压滴法 ）：）：n(1) 制备菌液制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有12mL无无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。n(2) 取取23环稀释菌液于洁净载玻片中央，再加入一环环稀释菌液于洁净载玻片中央，再加入一环0.01%的的美蓝水美蓝水溶液，混匀。溶液，混匀。n(3) 用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢

13、地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。n(4) 镜检镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。高倍镜观察。n要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。二、细菌运动性的观察（二、细菌运动性的观察（悬滴法悬滴法）：）：n1.制备菌液：制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加在幼龄菌斜面上，滴加3-4mL无菌水，制成轻度混浊的菌无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。悬液

14、。n2.涂凡士林：涂凡士林：取洁净无油的盖玻片取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林（或块，在其四周涂少量的凡士林（或香柏油）。香柏油）。n3.滴加菌液：滴加菌液：加加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。n4.盖凹玻片盖凹玻片 将凹玻片的凹槽对准盖将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的转凹玻片，使菌液正好

15、悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥。液干燥。n5.镜检镜检 先用低倍镜找到标记，再稍先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。观察。n由于菌体是透明的，镜检时由于菌体是透明的，镜检时可适当可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。便于观察。n镜检时要仔细辨别是镜检时要仔细辨别是细菌的运动细菌的运动还还是是分子运动分子运动（即布朗运动）。（即布朗运动

16、）。实实 验验 程程 序序（无菌操作技术（无菌操作技术 ）n1. 用接种环转接菌种用接种环转接菌种n点燃酒精灯点燃酒精灯n左手夹住两试管：斜面向上，左手夹住两试管：斜面向上，450度角。度角。n灼烧接种环灼烧接种环n右手拔棉塞，管口过火右手拔棉塞，管口过火n取菌取菌，接种接种，标记标记，培养培养n2.平板划线技术平板划线技术n用接种环取菌悬液或菌苔。在近火焰处，左手拿皿底，右手用接种环取菌悬液或菌苔。在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，划线，方法如下（拿接种环，划线，方法如下（划线的方法有很多划线的方法有很多（平行划线、（平行划线、“之之”字划线）字划线），但无论采用哪种方法，其目的都是通过划，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，培养后能形成单菌落线