病生理动物实验技术

1、实验一 动物实验的基本操作技术第一节 实验动物的选择常用的实验动物有兔、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、鸽子、蟾蜍、青蛙等，个别实验需选用猴或者猪。要获得理想的实验结果，必须选用健康状况良好的动物。一般地说，健康的温血动物表现为行动活泼、反应灵活、毛色光泽、两眼明亮、食欲良好等。健康的蟾蜍和青蛙皮肤湿润、喜爱活动。如果进行慢性实验，还应选择年轻健壮的动物。体弱年老的动物往往反应迟钝或过敏，对麻醉和手术耐受性差，术后也不容易恢复，这样会影响实验结果、要根据实验内容和要求选择合适的健康动物。现将机能实验学教学中常用实验动物的用途简介如下。1、狗经过训练的狗，可与人合作，很适合用于慢性实验，特别适用于需要

2、训练的清醒实验，如条件反射试验。狗的体型大，对手术的耐受性较强，常用于其他许多小动物不宜进行的手术中，如胃瘘、肠瘘、膀胱瘘、胆囊瘘和颈动脉桥等。还能用狗复制多种机能实验动物模型，如水肿、炎症、电解质紊乱、酸碱平衡障碍、缺氧、休克、心律失常、肺动脉高压、肝淤血、实验性腹水、肾性高血压等。在进行临床前毒性试验时，狗也是常用的动物。2、家兔目前我国实验用的家兔主要有：中国本兔，又称白家兔，毛色多为纯白、红眼睛，是我国长期培育的一个品种，成年兔的体重为1.53.5kg;青紫蓝兔（山羊青兔或金基拉兔），毛色灰银，成年兔的体重为2.53.5kg；大耳白兔（日本耳白），毛色为纯白，红眼睛，两耳长大，血管清晰

3、，便于静脉注射和采血，成年兔的体重为46kg。家兔性温顺，易饲养，繁殖率高，容易找到条件类似的对照兔组，而且价格低廉，在许多实验研究中可以替代狗进行各种实验和复制多种病理生理模型。例如；家兔常被用来做直接记录血压、呼吸等的急性实验；在研究主动脉弓压力感受器反射时，常选用家兔，因为它的降压神经在颈部和迷走、交感神经分开行走而单成一束，便于研究降压神经与心血管活动的关系，如果选用大鼠或猫，则因其降压神经与其他神经混合在一起走行，所以给研究带来困难；家兔心脏在离体情况下搏动很久，是观察药物或有害因子对哺乳类动物心脏直接作用较适合的一种模型；成年家兔可诱发排卵，可用来观察药物对排卵的影响；离体兔耳、兔

4、心的各种分析性研究，更为一般研究者所采用；家兔对许多病毒和致病菌非常敏感，通过家兔的预先感染，可进行许多抗传染药物的研究，也常用作研究发热、解热药和检查致热原。3、小白鼠小白鼠是医学实验最常用的一种动物。由于繁殖力强，价格低廉，对实验动物同种、纯种、性别和年龄的要求比较容易满足，生活条件也容易控制，因此应用极广，特别适用于需要大量动物的实验，如药物筛选、半数致死量、药物的效价比较等。小白鼠对多种疾病有易感性，可以复制多种疾病模型，如血吸虫病、疟疾、流感、慢性气管炎、脑炎等。用人工接种或化学致癌法可以复制各种癌、肉瘤、白血病。小白鼠对外界环境适应性差，不耐冷热，经不起饥饱，比较娇嫩。因此，做实验

5、时动作要轻，要耐心细致，否则影响实验结果。4、大白鼠大白鼠性情不如小白鼠温顺，易受惊。当其受惊时，表现凶恶，易咬人，雄鼠间好斗，如饲养管理不安全，常会互相咬伤。在医学实验中，大白鼠不如小白鼠、兔的用途广泛，但仍可用于多中实验和复制多种动物模型,特别是需要做较大体形的实验，如直接记录血压，或用大白鼠做胆管插管收集胆汁以及肺水肿等实验，也可用于研究休克、DIC的血液循环变化。大白鼠后肢可做血管灌流实验，心脏可做离体心脏实验。大白鼠的垂体肾上腺功能很发达，常用来做应激反应和肾上腺、垂体等内分泌功能实验。大白鼠的高级神经活动发达，因此，也广泛应用于神经功能症的研究。5、豚鼠豚鼠又名天竺鼠，荷兰猪，可分

6、为短毛、长毛和刚毛三种。一般动物实验多用非纯种短毛豚鼠（三色、两色或单色）。豚鼠性情温顺，不抓人，不咬人，繁殖快，饲养管理要求低，对若干病原微生物较易感染，反应较一致，因此也是实验中的常用动物之一。它可用于复制哮喘、组织胺过敏、结核病、白喉、螺旋体、百日咳、数以等疾病的研究。在过敏性疾病、免疫及血管反应等研究中应用的也比较多。6、蟾蜍和青蛙蟾蜍和青蛙是实验室常用的一种动物。特别在生理、药理实验中更为常用。蟾蜍、蛙的心脏在离体情况下仍可有节奏的搏动很久，所以常用来研究心脏的生理功能、药物对心脏的作用等。蟾蜍、蛙的腓肠肌和坐骨神经可以用来观察外周神经的生理功能，药物对周围神经、横纹肌和神经肌肉接头

7、的作用。第二节 实验动物的编号 在科学实验中为了观察每只动物、各组动物的变化情况，必须在实验前预先对动物进行随机分组和标号标记。对于比较大的动物如狗、兔等，可将号码烙在圆形的金属牌上，实验室将其固定在狗链条或兔耳上。对于家兔还可采用化学药品涂染被毛或采用兔耳打孔法。下面以机能实验室最常用的动物为例，介绍大鼠和小鼠的编号标记方法。 大鼠和小鼠的编号一般都采用各种不同颜料涂擦被毛的方法来标记。常用的涂染化学品如下： 涂染红色，用0.5%中性红或品红溶液； 涂染黄色，用35%苦味酸溶液； 涂染咖啡色，用2%硝酸银溶液； 涂染黑色，用煤焦油的酒精溶液。最常用的是35%苦味酸溶液。用毛笔或棉签蘸取此溶液

8、，在动物固定的不同部位涂上苦味酸黄色斑点表示不同号码。一般习惯涂染在左前腿上为1，腰部为2，在左后腿上为3，在头部为4，在正中为5，在尾基部为6，在右前腿为7，在右侧腰为8，在右后腿上为9，不涂染鼠为10，且2099以内，可采用在上述动物同一部位上，再涂染另一种染色剂（如0.5%中性红或品红溶液）斑点，表示相应的十位数。例如在左前腿标记红色和黄色斑点，这就表示11；如果红色标记在左前腿上，而黄色标记在左腰部，这就是12，以此类推。标记要有记录，做到实验者心中有数，一面时间长忘记。 9号鼠 12号鼠 小白鼠还可采用剪耳法来标记号码，即在耳朵不同部位剪一个小孔来表示一定的号码。此外小白鼠尚可采用足

9、指剪断法来标记号码。 第三节 药物浓度与计量的计算在需要为动物给药的时候，经常会遇到两个问题：给多大剂量？应配成何种浓度，用多少毫升？现简要叙述如下。（一） 给药计量的确定药物对于某种动物的适当计量来自经验，不能凭空推算。要解决这个问题，首先应该查阅该药的有关文献，了解前人经验。如果能查到用于同一目的的实验且给相同种类动物用药的剂量，那就可以直接应用。有时候查不到治疗剂量，但知道LD50，也可用（1/51/3）LD50来进行试验。如果查不到待试动物的剂量，但知道其他动物或人用剂量，这就需要换算。不同种类种类动物间用药剂量的换算，一般按单位体重所占体表面积的比例进行换算，如下表所示。例 某一利尿

10、药，给大白鼠灌胃给药时的剂量为250mg/kg。请粗略的估计狗灌胃给药时的剂量。如按上表进行计算，12kg狗的体表面积为200g大白鼠的17.8倍。200g大白鼠需给250×0.2=50mg，于是狗的适当剂量应是50×17.8÷12=74mg/kg。上述不同种类动物间剂量的换算法只能提供一个粗略的参考值。究竟是否恰当，只有通过实验才能了解。（二） 药物浓度与给药剂量的计算1、 药物浓度的表示方法一定容积的溶液中所含溶质的量称为溶液浓度。常用的浓度表示方法有如下几种。1）百分浓度 每100ml（或100g）溶液中所含溶质的克数或毫升数，用“%”表示。例如，25%戊巴

11、比妥钠溶液，即指100ml溶液中有戊巴比妥钠25g。计算公式为百分浓度（%）=溶质的质量(g)/溶液的体积（ml）×100%2）比例浓度 药典中常见的比例浓度符号为1：X，即指1g固体或1ml液体溶质加溶剂配成Xml的溶液，叫做比例浓度。如不特别指定溶剂种类时，都是以蒸馏水为溶剂。例如，重碳酸钠15g配成300ml溶液的比例浓度如下。比例浓度=1：（300/15）：203）摩尔浓度 以1L溶液中所含溶质的摩尔数来表示溶液的浓度，叫做摩尔浓度，用符号mol/L表示。2.给药剂量的计算 一般按“mg/kg”或“g/kg”体重计算。例如，体重20g的小白鼠按每千克体重注射15mg盐酸吗啡计

12、算，如果吗啡浓度为0.1%，应该注射多少毫升？首先计算出20g小白鼠注射盐酸吗啡的量为20/1000:x=1:15,x=0.3mg；其次计算出0.3mg相当于多少毫升0.1%的吗啡？0.1%即1mg/ml，所以应注射0.1%的盐酸吗啡0.3ml。第四节 动物的捉拿和固定方法动物的捉拿和固定方法是进行动物实验的基本操作之一，实验者应当熟练掌握。首先应对动物的一般习性有所了解，采用相应温顺的方法迅速将其固定在便于实验操作和观察记录的体位。下面介绍几种常用动物的捉拿方法。（一） 狗的捉拿和固定狗的性格凶猛，能咬人。捆绑固定至少由23人进行。实验者先抚摸，逐步接近，勿使其惊恐或将其激怒。用粗麻绳兜住狗

13、的下颌，并在上颌打结（勿太紧）。操作时，绳头相距应稍远些，并注意狗的动向，以防被狗咬伤，最后在狗耳根后颈项上打一个活结。如狗不合作，则先用一根特制长柄狗头夹，从后面夹住狗颈，限制狗头部活动，再按上述方法捆住狗嘴。然后将狗侧卧，一人固定其肢体，由另一人注射麻醉药。（二） 猫的捉拿和固定捉猫时应戴手套，以防止被其抓伤。先将猫关入特制玻璃容器中，投入乙醚面团快速麻醉，取出后趁其未醒立即固定。（三） 家兔的捉拿和固定正确的捉拿方法是：一手抓住颈背部皮肤，轻轻提起，另一手托其臀部，使家兔呈坐位姿势，切忌提拿双耳。按实验要求家兔常用兔盒固定或兔台固定。兔盒固定适用于耳血管注射、取血或观察耳部血管变化等。兔

14、台 固定适用于观察血压、呼吸进行颈、胸、腹部手术。 （四） 大鼠的捉拿和固定大鼠在惊恐或激怒时会咬人，捉拿时需注意。无经验者可带防护手套，并应动作轻柔，切忌粗暴或用钳子夹持。实验者可用手捉住鼠尾，将鼠放在鼠爪能抓牢的物体表面，并稍向后拉鼠尾，鼠本能的向前爬行。此时实验者左手掌面向鼠背，食指压住鼠头顶，拇指和中指分别从两侧腋下插入，将鼠两前肢卡住，或拽紧鼠后颈及后背皮肤，使其腹面向上，做腹腔注射麻醉，然后固定。可将鼠用金属筒或铁丝笼式固定器固定，露出尾部，做尾静脉注射。 试验二 水 肿【目的和原理】掌握蟾蜍下肢灌流标本的制作过程；了解影响机体水肿的因素；观察水肿的表现特征。发生水肿的基本原因有两

15、大类：一是由于肾小球滤过率下降（或）和肾小管、集合管回；吸收增强引起的钠水潴留，另一类是由于血管内外液体交换失衡引起的组织液生成过多。而本实验与蟾蜍肾脏功能无关，故造成蟾蜍下肢标本水肿的原因是血管内外液体交换失衡。本试验通过分别向所制备的标本的血管中快速灌注等渗晶体（任氏液）和等渗胶体（代血浆-20%葡萄糖）来改变血浆胶渗压。当灌注任氏液时，血管内血浆胶渗压下降，最后甚至可降至“0”，液体则通过血管壁由血管内流向组织间隙形成水肿。标本的外观也可发生明显改变。而当灌注20%葡萄糖时，由于血管内血浆胶渗压的逐步提高，液体则由组织间隙通过血管壁会流入血管内，而是原来的水肿减轻甚至消失。【实验对象】蟾

16、蜍。【实验器材】蛙板、毁脑脊髓针、普通剪刀、眼科镊、眼科剪、1ml注射器、一号针头、灌流装置、天平砝码一套、1%肝素。任氏液100ml、20%葡萄糖溶液100ml、弯盘、纱布、丝线、棉球、胶片。【实验步骤】（一） 灌流装置的准备在灌流装置上端的两个分液漏斗内分别加入任氏液及20%葡萄糖各50-100ml，用任氏液灌满整个灌流系统。注意从莫菲氏管液平面以下不能有气泡。（二） 蟾蜍后肢标本的准备（1） 取较大蟾蜍一只，用会脑脊髓针上下捣毁脑和脊髓后，将其腹面向上平放于蛙板上。（2） 沿正中线偏右侧剪开腹部皮肤达腹腔，找到腹静脉，向心方向注入1%肝素1ml以达到全身抗凝，注射后用棉球压迫约1min。

17、（3） 将其内脏推向上方，沿蟾蜍右肾外援剪开后腹膜。此时可看到沿脊柱走行的背主动脉。将背主动脉与周围组织分离，并在其下穿两根线。（4） 拉紧上方一根线结扎，用普通剪刀剪断结扎线以上的脊柱。将离断下来的头、脑及上肢部分全部弃去，并剔除全部腹腔脏器。（5） 将灌流装置下端充满任氏液的针头插入背主动脉，注意穿刺部位应尽量高一些，以免插入背主动脉分支（髂动脉）。用下方一根丝线将针头固定，浆制备好的标本放在胶片上，连同胶片一起置于天平上（注意此时天平的载物盘应反扣，以免在实验过程中贮存液体而影响实验结果）。（6） 立即用灌流装置内的任氏液冲洗下肢标本血管床内的血液，直至流出的液体呈淡黄色。（三） 灌流（

18、1） 先用任氏液进行灌流。记录标本此时重量，并记录此时的时间及灌流速度（滴/min）。以后每隔5min称重一次，共称重四次。观察其重量有何变化和下肢外形有何变化。（2） 再用20%葡萄糖进行灌流。关闭分液漏斗的任氏液一侧，停止任氏液灌流，打开20%葡萄糖一侧，改变葡萄糖灌流。待1-2min后再如前每隔5min称重一次，共称重四次。观察下肢重量及外形变化。【注意事项】（1） 打开腹腔时应沿右侧进行，以免损伤腹静脉。（2） 下肢标本应保留皮肤，以利于观察外形改变。（3） 若头皮针插入髂动脉，则重量的变化不太明显，但外形的改变会和对侧形成明显对照。 思考题(1) 根据结果分析本实验过程中水肿发生的机

19、制是什么？(2) 根据所学原理分析为何不同液体会产生不同的结果，机制如何？实验三 缺 氧【目的和原理】氧为生命所必需。一旦发生缺氧，组织的代谢、功能甚至形态结构都可能发生异常变化，进而引起死亡。当吸入气的氧分压过低时，血氧含量和血氧饱和度降低，血液实际含氧量减少，氧弥散入细胞的速度减慢，造成组织缺氧。而当血红蛋白的性质因某种原因改变时，携带氧的能力和（或）与氧的亲和力发生改变，使机体氧容量和氧含量下降，或降低者是血红蛋白结合的氧不易释出，结果导致机体缺氧。本实验通过将动物分别置于缺氧和含一氧化碳气体的密封瓶中，复制低张性、血液性（一氧化碳中毒）缺氧的动物模型，了解两种类型缺氧的表现及发病机理。

20、【实验对象】小白鼠【实验器材】200ml广口瓶、橡皮管塞、L型玻璃管、乳胶管、弹簧夹、U型夹、眼科剪、眼科镊、肾型弯盘、毛细玻璃管、铁纱、5ml注射器、氧气袋、天平、砝码、酒精灯、10ml量筒、50ml烧杯、甲酸、硫酸、20%氢氧化钠（或碱石灰）、测耗氧量装置、一氧化碳发生装置。【实验步骤】（一） 低张性缺氧（1） 如图2-34-1所示，取广口瓶一个，放入铁纱网，使其与平地保持约3cm的距离。用量筒去20%氢氧化钠10ml或碱石灰少许（约5g），将广口瓶稍倾斜，将氢氧化钠沿瓶壁缓慢注入瓶内（勿溅到铁纱网上）（2） 用烧杯往测耗氧量装置中加入清水，调整液面至30ml刻度处，并使该液面与广口瓶引出

21、的水平管处于同一水平，然后用弹簧夹夹闭中间连接的乳胶管。（3） 取小白鼠一只，用天平称重后放入此广口瓶内，塞紧瓶塞，严防漏气。记下时间。（4） 观察动物的呼吸频率、幅度及耳、四肢、尾和口唇的颜色，每5min记录一次呼吸变化，观察小白鼠的表现直至动物死亡。（5） 待动物死后，立即打开弹簧夹。这时测耗氧量装置中的水流向广口瓶内。当液体流动停止后，记下测耗氧量装置中液面下降的毫升数。（6） 打开瓶塞，取出小白鼠，快速用毛细玻璃管目眦内取血。观察血液颜色，并留做与正常血液颜色比较。（7） 计算小白鼠的耗氧量。耗氧量ml/(g·min)=总耗氧量（ml）/体重(g)×存活时间（min

22、）。（二） 一氧化碳中毒（血液性缺氧）1 解救（1） 取小白鼠一只，内眦取血。观察血液颜色，并留做与缺氧动物血液颜色进行比较。（2） 如图2-34-2所示，将该小白鼠放入广口瓶中，塞紧瓶塞。用弹簧夹夹闭由该瓶塞引出的乳胶管。（3） 在一氧化碳发生装置中加入6ml甲酸。3ml硫酸，在试管底部点燃酒精灯。待管中液体沸腾并产生气体时，用一支5ml注射器从一氧化碳发生装置接口处采集3ml一氧化碳，经瓶塞所连接的乳胶管注入瓶内，将瓶体倒置越1min后方正。此举目的是混匀瓶中气体。（4） 密切观察动物的变化。当小白鼠站立不稳时，立即打开瓶塞，取出小白鼠。将氧气袋上的U形夹打开，对准小白鼠口鼻部吹氧，直至小

23、白鼠清醒。2.不解救（1） 取小白鼠一只放入广口瓶中，塞紧瓶塞。用弹簧夹夹闭由该瓶塞引出的乳胶管。（2） 用一只5ml的注射器从一氧化碳发生装置从接口处采集3ml一氧化碳（一氧化碳气的产生同前），经瓶塞所连接的乳胶管注入瓶内，将瓶体倒置约1min后放正。（3） 待小白鼠死亡后从瓶中取出，并立即目内眦去学。观察血液颜色，并留做与正常动物血液颜色进行比较。3.观察比较解剖低张性缺氧、一氧化碳中毒（血液性缺氧）致死的动物和正常死亡动物（一氧化碳中毒经解救后恢复正常的动物可视为正常动物），观察它们的内脏、口唇、耳、四肢及尾部皮肤的颜色，比较它们的血液颜色。（三） 亚硝酸钠中毒性缺氧（1） 取体重相近的

24、小白鼠两只，观察正常表现后分别向腹腔内注入5%亚硝酸钠0.3ml。注入亚硝酸钠后，其中一只立即腹腔内注入1%美兰0.3ml，另一只注入生理盐水0.3ml。（2） 观察指标（一），比较两鼠表现及死亡时间。 思考题（1） 本实验中动物产生低张性缺氧、血液性缺氧的机制是什么？（2） 为什么低张性缺氧和一氧化碳中毒（血液性缺氧）动物的血液及内脏、皮肤的颜色不同？（3） 紫绀的临场意义是什么？（4） 给一氧化碳中毒的动物吸氧进行解救的理论依据是什么？（5） 亚硝酸钠中毒为何种类型的缺氧？为什么？（6） 各种类型缺氧对呼吸有何影响？血液颜色有何不同？ 实验四 休 克一、 失血性休克【目的和原因】休克时一种

25、临床常见的危重病理过程。通过使病人发生微循环障碍，引起重要生命器官血液灌流不足，从而导致细胞功能紊乱。大量失血是引起休克的常见原因，由此原因引起的休克称为失血性休克。在休克的不同时期，由于大量失血，有效循环血量减少，导致机体交感肾上腺髓质系统兴奋，毛细血管前阻力增加，微循环出现灌少于流的情况。在此期，由于机体的“自我输血”、“自我输液”等代偿机制，病人的血压可不下降。若病因没有及时去除，病情继续发展，长期的缺血与缺氧导致机体发生酸中毒。酸中毒使得血管平滑肌对儿茶酚胺的反应性降低，大量毛细血管开放；而微静脉由于对酸性环境的耐受性比较强，故仍然处于收缩状态。结果大量血液静进入，并淤积在毛细血管内，

26、微循环出现灌大于流、血液淤滞的情况，病人进入淤血缺氧期。此时由于微循环血管大量开放，大量血液淤积在毛细血管中，造成有效循环血量减少，病人血压进行性下降，进入失代偿状态。此后，由于血液淤滞，血液粘度增加，缺氧和酸中毒造成血管内皮和组织损伤，激活凝血系统，从而引起DIC。本实验的目的是通过给动物放血，复制失血性休克动物模型，观察休克时机体的主要变化并探讨其发病机理，了解扩容治疗的疗效和原则，以增强对休克的感性认识。【实验对象】家兔。【实验器材】止血钳、外科剪、眼科剪、眼科镊、普通剪刀、动脉夹、三通、动、经脉插管、注射器（50ml、10ml、5ml、1ml）、烧杯（500ml、100ml）、缝合线、

27、线绳、布带、胶布、纱布、兔台、输液装置、生物信号分析仪、压力传感器、心电图连接电极、显微镜、20%乌拉坦、1%肝素、去甲肾上腺素、生理盐水。【实验步骤】（1） 取家兔称重后，经耳缘经脉缓慢注射20%的乌拉坦1g/kg（500ml/kg）麻醉，然后仰卧位固定于兔台上。（2） 用普通剪刀剪去颈部的毛。自甲状软骨沿颈部正中向下剪开皮肤，切口长约4cm（不要过于向下，以免损伤胸膜，造成气胸）。用止血钳在一侧颈部浅层肌肉下钝性分离出一条颈外浅静脉。沿颈部正中钝性分离颈部肌肉，暴露气管，在气管两侧分离出两侧颈总动脉。在分离出的动、静脉下各穿入两条缝合线备用。（3） 结扎颈外浅静脉远心端，用眼科剪在管壁上剪

28、一小斜口，由此插入静脉插管。用一条线结扎固定插管。插管的另一端与事先加好生理盐水的输液装置连接。打开输液夹，调整输液速度为510滴/分钟，此举的目的为保持静脉通常。（4） 将压力换能器与生物信号分析仪相连接，在压力换能器和其所连接的塑料导管中注入1%肝素溶液。打开生物信号分析仪。（5） 取一个三通，一端与压力换能器所连接的塑料导管相连；另一端与含有肝素溶液的动脉插管相连；第三端留作放血使用。暂时关闭连接动脉插管的一端。（6） 选取一侧颈总动脉，结扎其远心端，在另一端缝合线的近心端测用动脉夹夹闭颈总动脉。提起远心端的结扎线，用眼科剪在管壁上剪一小斜口，插入动脉插管，用远心端的那条缝合线结扎固定插管。松开动脉夹，打开三通，使血液与压力换能器相通，以描记动脉血压。同时，关闭三通的放血端。（7） 用普通剪刀剪去家兔腹