Western blot实验流程--精选文档

1、Western blot一.仪器及器皿：棕色广口瓶5个(50ml)，灭菌，烧杯3个灭菌，EP管，枪及枪头，分光光度计，超声破碎机，冷冻离心机，灭菌0.9%生理盐水，冰，灭菌水(1000ml)，两套灭菌器械。二.药品配制：1.TBS×10(Tris Buffered Saline)：2.42 g Tris base 8g NaCl100ml H2O, 用HCl调pH 7.6 ，4°C保存.(配TBST用)TBST=TBS+0.05%Tween2TBS ：0.303 g Tris base 0.4383g NaCl (150mM) 0.05gSDS用HCl调pH至8.0(配裂解

2、液用)，50ml约用2.1mlHCl。30.5M Tris-HCl(pH6.8),50ml,:3gTris-base加灭菌水约30ml,用6N盐酸缓缓调pH至6.8（约用1ml），定容至50ml，4保存。(若调小了，用5.6%NaHCO3调回) 。1.5M Tris-HCl(pH8.8),50ml,9.08gTris-base加灭菌水约40ml,用6N盐酸缓缓调pH至8.8（约用2ml），定容至50ml，4保存。45×Running buffer pH8.3,500ml：Tris-base 7.5g, Glycine(甘氨酸) 36g,SDS 2.5g加灭菌水至500ml, 4保存,

3、用时若有沉淀析出可提前拿出置37，不用调pH值，用时按1：5稀释，即60ml的5×Running buffer加入240ml水。530%acrylamide(丙稀酰胺贮液)：8.76g acrylamide, 0.24g N, N'-methylene-bisacrylamide(亚甲基双丙烯酰胺)，加少许 灭菌H2O搅匀，最后定容至30 ml 。用0.45 µm的过滤器过滤后4°C避光保存610%SDS：5gSDS+50 ml H2O,(难溶，需较长时间)，常温保存。7.10%APS (ammonium persulfate，过硫酸铵(粉剂也保存在4&#

4、176;C)：100mg APS +1ml H2O,EP管中即可，4°C保存1周，-20°C保存1个月，时间长了胶难凝。.8. 0.1% bromophenol blue dye溴酚蓝10ml溴酚蓝10mg加ddH2O至10ml，搅匀溶解，过滤除去未溶颗粒。9. 2×Sample buffer(1:1)避光保存 10%SDS (1g/10ml) 400l 0.5M Tris(pH6.8) (0.6055g/10ml) 250l 100% Glycerol(甘油，丙三醇) 200l 2-mercaptoethanol(巯基乙醇) 100l 0.1% bromophe

5、nol blue (10mg/10ml) 80l总计1030l 避光4°C保存。4×Sample buffer(1:1)避光保存：10. 胶Stain Solution(蛋白染液):100mgCoomassie Brilliant Blue G 250(考马斯亮蓝)溶于50ml95%的乙醇，加入100ml 85%的H3PO4,及50mlddH2O, 4°C保存于棕色瓶中。Coomassie Brilliant Blue R 250(考马斯亮蓝-R250)： R250 0.5g 甲醇 225ml 定容至500ml 冰醋酸 50ml11. 胶Destain Solut

6、ion(脱色液)for Coomassie Brilliant Blue：acetic acid(冰乙酸) 100mlmethanol(甲醇) 100ml加水至1000ml .若转完膜后染色则不用10及11，改用12和13。12.NC膜染色液：0.1%氨基黑染液：氨基黑 0.2gmethanol(甲醇) 90ml冰醋酸 20ml加水至200ml.13NC膜脱色液：methanol(甲醇) 180ml冰醋酸 4ml加水至200ml.14配转膜液(transfer buffer)： Tris 6.06g Glycine 28.8g Methanol (甲醇) 400ml DDH2O to 2000

7、ml，混匀后不用调pH值， 4保存。(提前将前两种配成800ml，为2×transfer buffer转膜时取400ml加入400mlH2O，另加200 ml Methanol (甲醇)即可)。注：所用水最好为灭菌的去离子水便于长期保存。15.Tris-Gly 电泳缓冲液（5X）Tris 15.1gGly 72.0gSDS 5.0g去离子水定容至1L，室温保存三 实验步骤.(一)提取蛋白并测蛋白浓度：1开离心机，4 °C ；2. 配裂解液： 1mlTBS(pH至8.0)加入10lNP-40,1lPepstatin(1g/ml), 胃蛋白酶抑制剂A，溶于DMSO（二甲基亚枫）

8、，-20°C保存1lLeupeptin(1g/ml), 亮抑蛋白酶肽，溶于ddH2O,-20°C保存1lAprotinin(1g/ml),抑蛋白酶肽，溶于ddH2O,-20°C保存。5lPMSF(100g/ml),phenyl methylsulfonyl fluoride ,苯甲基磺酰氟，溶于异丙醇（isopropanol），-20°C保存。3拿冰置于冰盒内，裂解液配好后即放于冰水上；4用1%戊巴比妥钠麻醉后取材，最好小于100mg，用冷TBS或冷生理盐水冲洗后（做蛋白最好灌流，做RNA要用70%酒喷毛，若不即用可在液氮中冷冻30min后，-70

9、76;C保存），加入裂解液(100mg/ml)，放于冰上，剪碎组织；剩余裂解液仍放于冰上，以备稀释样品用；5超声破碎，小烧杯内有冰，EP管置于冰水上，稳定并降温，4×10s，560W，间隔10S，超至无块状即可；6离心4 °C，12000g，20min离心机转动时打至time档性能稳定7.蛋白定量：配标准蛋白，成倍数(根据药盒说明，有线性关系的浓度分别为0,0.15，0.3，0.6，0.9g/l ，因此0.3g/l 的标准蛋白各取0.5，1，2，3l，并加入1ml染液；震荡混匀，测标品吸光值595nm，再由低浓度向高浓度测。做标准曲线，准备蛋白定量使用。9取超声破碎好的上清

10、放于新EP管中，放于冰水上，取1l加19l ddH2O稀释20倍，从中再取1l加入1ml染液，室温后5min，测吸光值，应在混匀后30min之内测完。10对标品用Excel做图，输入吸光值及对应浓度（包括空白），做散点图，完成图后添加趋势线，截距为0，公式及R2(相关系数)均选，得到相应公式（Y= B×X），再计算浓度即可，结果应×20(稀释倍数)。加样时每个孔应有50g,用50/浓度即为加样量l。样品即用可放于冰上，否则分装后放于-80。补：7-10步测定蛋白浓度，也可以用买的蛋白定量试剂盒补2：若样品为细胞样品时：（在冰上进行）（不用蛋白定量的操作）1、 六孔板长满后，

11、用PBS洗3遍，用裂解液和2X buffer1:1混匀的液体加入每孔100ul左右裂解。然后用刮刀刮下来，没刮一个孔要在三次水中洗一下刮刀。2、 煮30min，95。-20保存。用的时候拿出来化，离心取上清。（需要蛋白定量的操作）1、 裂解用液为： 裂解液：抑制剂 = 1:1。收完蛋白后先离心，1000r/min，离心8min。吸出上清，弃掉沉淀。2、 96孔板，水 + 标准品（BSA，2mg/ml）总共20ul 蛋白（4ul） + 水（16ul） 20ul 0 19ul 1 18ul 2 16 4 14 6 12 8 10 10所有孔（即每孔）加100ul显色剂（BCATM:BCA) = 1

12、：50混合），注意避光3、37孵育40min4、王黎明的程序里有BCA的程序测定（最后的配平用液也是裂解液：抑制剂=1:1）5、定量的同时，同体积的蛋白和2Xbuffer一起煮30min，95.-20保存。蛋白分子量范围分离胶凝胶浓度（%）<100020-301-4000015-2040000-10000010-15100000-5000005-10>5000002-5(二)电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis）1 检查电泳所需的各种试剂和器械，并从4拿出药品；2 清洗电泳所用的玻璃板（平时浸泡于洗洁精液中），擦酒精(70%)，晾干或6

13、0-70烤干；3 装置电泳玻璃板（长板在内短板在外）并固定（卡住）；4 配胶：之前先用水检查是否漏胶，两片玻璃要对齐，以免漏胶。 1.5mm玻璃板用7ml，1mm的玻璃板用5ml分离胶浓缩胶6%8%7.5%10%12%4%5% （2ml）5%（5ml）ddH2O2.62.32.42ml1.576ml1.68ml1.2ml1.4ml3.5ml30%Acrylamide(4避光)11.31.25ml1.36ml2ml0.27ml0.33ml0.825ml1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.31.31.25ml1.00ml1.25ml-0.5 M Tris-HCl(pH6.8)-0.5ml0

14、.25ml0.625ml10%SDS505050l40l50l20l20ul50ul10%APS(后加)505050l40l25l20l 20ul50ulTEMED（后加）432.5l2.0l2.5l2l2ul5ulToTal5ml5ml5ml4ml2mlAPS（先加） 和TEMED要最后用时再加，混匀，每边用枪从板左上角加入4ml，枪头内胶不要全推出，即再吸再加入，防止出气泡，加胶比5cm的刻度线稍高，用去离子水或乙醇滑行方式加满覆盖压住胶（因为只在一角加入会使胶面不平），使凝固（水封下出现折光面），约0.5-1h，除去水层，用水冲洗2次，并用滤纸吸干残留的水分；等约30min。加入浓缩胶,

15、每边加满，立即插上梳子（平整面朝内，先一端插入，缓慢斜放至另一端插入）注意不要有气泡，可用70%酒精排出；等30min左右。加完浓缩胶立刻开始准备样品，并打开水浴锅，100；胶凝后（可见齿边缘与胶有空隙）垂直拔出梳子，两边同时用力；先用去离子水冲洗加样孔，再用Running buffer冲洗；5准备样品，每孔使用总蛋白量50微克，计算使用的样本量，根据loading buffer的浓度，加样量为10l，即样本量(50/浓度)用裂解液补充总体积至5l再加入5l Sample buffer （2×），另有marker 和一个Sample buffer（1×），上样时加在一侧（防

16、止跑歪），也可不用。（先加水，再加5l Sample buffer，最后加蛋白），加完后离心再100水浴5min后放于冰上，准备上样。 两边两道buffer，左边一道marker。6放好电泳槽，将制好的胶板反过来（短面在内，如果跑单面胶，则放置好胶板后，另一面放塑料板，字面向内，夹紧），外加旧缓冲液Running buffer，两板之间加入稀释5倍的新缓冲液Running buffer(约用150ml，即35ml5×+140ml水)。上样。浓缩胶时80V，30min，分离胶时120V，45min（等条带齐了就可以换电压了）。（若在冰盒中电泳，时间可稍延长，但是浓缩胶一定要跑完才可以变

17、电压再跑分离胶）。(三)电泳转膜（冰上进行）1溴酚兰快达底部即可停止电泳；2(切下Marker及样品1、 2、3的胶，用Coomassie Brilliant Blut G(考马斯亮蓝)染色约30min（摇床）后用Destain脱色液脱色2h，并于凝胶成像中观察)此步可省，可在转完膜后，将膜剪下再用氨基黑染色（或者丽春红染色）；3.配转膜液1000ml：取400ml 2×transfer buffer加入400mlH2O，另加200 ml Methanol (甲醇)即可；再加入1ml10SDS利于转膜；或者10X转膜液：甲醇：双蒸水=1:2:7.4. PVDF 膜预处理：用甲醇浸泡1

18、minddH2O 3个5min转膜液浸泡15minNC膜（nitrocellulose membrane，硝酸纤维素膜）(8.5×5.5cm)直接用转膜液浸泡10min切4张8.8×5.8cm滤纸(Whatman 3mm层析纸),与海绵垫均用转膜液浸泡10min；切除浓缩胶(记清方向及要剪下染全蛋白的膜长度，并用铅笔标记于NC膜上)，将胶于转膜液中浸泡10min；5 摆放顺序夹子黑色面+海绵(聚乙烯板)+2滤纸+凝胶（剪左角）+NC膜（不分正反面）+2滤纸+海绵+夹子白色面（三明治），注意每放一层用玻璃棒赶一次气泡，并要始终保持湿润，否则胶易碎；将三明治固定在转膜槽内，且夹子黑色面对转膜槽黑色面；一定要赶净气泡，否则会产生高背景或影响蛋白转移。