实验一鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定

1、百度文库实验一鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定 一、实验目的：通过本实验的学习，掌握蛋白质的提取、分离、纯化及性质测定 技术，掌握高速冷冻离心机、可见分光光度计、核酸蛋白检测仪、电泳仪等仪器 的使用。二、基本原理：鸡卵类粘蛋白（chicken ovomucoid简称CHOM）：由鸡卵清中制成的一种糖蛋 白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用， 常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。/ 鸡卵类粘蛋白至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈不均一 性。目前至少已获得四种不同的组分，它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组 成上没有多

2、大区别，但是在糖蛋白的糖部分（主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸） 的含量上则有差别。它们的等电点有一定的范围，大致在 pH3.94.5。相对分子量28, 000。卵类粘蛋白抑制胰蛋白酶克分子比为1: 1,因此高纯度的卵类粘蛋白1微克能抑制相当于0.86微克的胰蛋白酶（比活力为 12, 000BAE印位/毫克蛋白）。不同来源的卵类蛋白末端基有很大差异，鸡卵类 粘蛋白N-末端基为丙氨酸（C一末端为苯丙氨酸）。卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的胭都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。鸡卵类粘蛋白除对牛和猪 的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌

3、蛋白酶也有一定的抑制作用，但对 胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。 本实验主要参照Kassell所述的方法，先将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA 一丙 酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，在经过DEAE千维素（二乙基氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品。三、试剂与器材3.1 粗提所需试剂：/丙酮，0.5M三氯乙酸，0.2M pH6.5磷酸盐缓冲液；/3.2 纯化所需试剂：、/0.02M pH6.5磷酸缓冲液，；DEAE纤维素32或52, 0.5M氯化钠-0.5M氢氧化钠 溶液，0.5M盐酸，0.02M, pH6.5磷酸盐缓冲液，0.30M氯化钠-0.02M

4、 pH6.5磷酸 盐缓冲液，1.0 M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，聚乙二醇8000,蔗糖。 3.3胰蛋白酶活力及粘蛋白抑制活力测定试剂： /0.05M pH8.0Tris-HCl 缓冲液，BAEE-0.05M,pH8.0 Tris-HCl 缓冲液（每毫升 Tris-HCl缓冲液含0.34毫克BAEE和2.22毫克氯化钙），结晶胰蛋白酶溶液 （0.4mg/mL, 0.1M pH8.0磷酸盐缓冲液配制）,0.4M NaCO （无水碳酸钠42.4g, 无离子水定溶至1000ml）, 0.4M三氯乙酸（三氯乙酸 65.4g,无离子水定溶至 1000ml）, 2%各蛋白溶液（干酪素5g,

5、用少量0.1M NaOHb口热溶解后，0.1M pH6.5 磷酸盐缓冲液定溶至250ml）, 100ug/ml酪氨酸溶液（105C烘干2小时的酪氨酸 0.1g,用少量0.1M HCl溶解后，无离子水定溶至100ml,即1000ug/ml,取10ml, 无离子水稀释至100ml即成100ug/ml）, Folin 乙试剂。3.4器材/新鲜鸡蛋、透析袋、层析柱（1.0*20cm）、贮液瓶（柱层洗洗脱用）、试管及试管 架、广泛试纸、擦镜纸、滤纸（7cmj）、移液管（0.5mL, 1mL、冰箱、计时器、 恒温水浴锅、紫外分光光度计、可见分光光度计、部分收集器、紫外检测仪（包 括记录装置）、高速冷冻离心

6、机、电磁炉、磁力搅拌器。四、操作步骤：（一）粗品的制备：由1枚新鲜鸡蛋大约获得25-30mL蛋清，盛于250m成杯 内，放置于温水浴锅内使温度达到 25-30 C,在不断搅拌下，缓慢加入等体积4c 预冷的三氯乙酸一丙酮溶液（0.5M TCA与丙酮的体积比为1: 2V/V）,立即出现 大量白色沉淀，加完后最终pH应为3.5 ,如高于pH 3.5，用0.5M TCA调到pH 3.5, 再继续搅拌30 min,然后在4c下放置1-2 h,离心（4000 rpm,20 min），约得25-30 毫升黄绿色精液。边搅拌边加入2倍于上清液体积的4c预冷的丙酮，可见白色沉淀产生，在 冰箱中放置1-2 h ,

7、离心（4000 rpm,20 min）,弃上清液，得沉淀，加入 2ml无 离子水，溶解沉淀，装入透析袋对水透析以除去残留的TCA透析过程中有少量沉淀出现，将透析袋中的溶液离心（4000 rpm,20 min）,弃沉淀，将上精液倒入 25mLM筒中，加入1/10上精液体积的0.2 M pH6.5磷酸盐缓冲液，摇匀，测量 并记录粗品总体积，可供下步上柱纯化之用。（二）纯化：2.1 DEAE-纤维素的处理及再生：新纤维素的处理：取50克DEAE纤维素-32或DE-52 （Whatmah8 口分装）, 用少量水溶胀1 h,用0.5M氯化钠溶液一0.5M氢氧化钠溶液（即1M氯化钠溶液 与1M氢氧化钠溶液

8、等体积混合，搅拌处理 20分钟、用大量的蒸储水洗至中性， 再用0.5M盐酸与0.5M氯化钠溶液搅拌处理20分钟、用大量的蒸储水洗至中性， 再用0.5M氯化钠溶液一0.5M氢氧化钠溶液处理一次，最后用大量的蒸储水洗至 中性，放置冰箱中保存。旧纤维素的再生：省去酸处理一步，只用 0.5M氯化钠溶液一0.5M氢氧化钠 溶液处理一次，用大量的蒸储水洗至中性，放置冰箱中保存。2.2 装柱：、/层析柱垂直安装在铁架台上，夹紧柱下端的硅胶管。先加入1/3-1/2柱体积的水，取一合适大小的玻璃漏斗，安装在柱的上端（使漏斗颈的外径与层析柱的 内径吻合，不能使层析柱中的水或缓冲液渗出）。将处理好的DEAE纤维素连

9、同 一些水倒入漏斗，不断搅拌，使之自然沉降到1cm左右的高度，打开柱下端的硅 胶管，继续搅拌、沉降至3/4柱高。将柱下短的硅胶管连接在核酸蛋白监测仪样 品池的入口。打开核酸蛋白监测仪电源，预热至少30min。2.3 平衡：打开蠕动泵/用0.02 M pH 6.5磷酸盐缓冲液平衡层析柱，最少用 3 倍柱体积的0.02M pH 6.5磷酸盐缓冲液平衡，平衡过程中，调节蠕动泵的流速， 记录柱下端流出速度，使之在 1-2ml/min之间。始终保持柱床上边最少有 2cm 高度的缓冲液，注意不能干柱，否则需重新装柱。,平衡过程中，调试核酸蛋白监测仪。首先将旋钮拨到T100%（旨透光率），调“光量”到显示1

10、00,再将旋钮拨到A （吸光度）（A有不同灵敏度，一般选择 0.5A）,调节“调零”到显示00继续平衡，如数字有波动，反复调节几次，使 A 值保持示为002.4 上样及洗脱：关掉蠕动泵，打开柱上端的螺扣，将柱床上边的缓冲液吸出，然后立即贴壁 加1ml样品（粗提样品），使样品全部缓慢流入层析柱床内，立即加0.02M pH 6.5 磷酸盐缓冲液到柱床上边保持 2cm高度。拧好柱上端的螺扣，打开蠕动泵，继续 以相同的磷酸盐缓冲液进行平衡，观察核酸蛋白监测仪的A值变化情况。当 A值急剧上升时，计时，同时以试管收集对应的流出液 （核酸蛋白监测仪的样品池 出口），每收集2ml,换一支试管，当A值上升到最高

11、值时，计时，下降到数值 稳定时，可停止收集流出液，这部分流出液主要为溶菌酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂 等杂蛋白。然后改用0.3M氯化钠-0.02M pH 6.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，同样， 当A值急剧上升时开始收集，计时，以试管收集对应的流出液（核酸蛋白监测仪 的样品池出口），每收集2ml,换一支试管，当A值上升到最高值时，计时，下 降到数值稳定时，可停止收集流出液，这部分流出液多为 具有抑制胰蛋白酶活性 的的卵类粘蛋白，即部分纯化的卵类粘蛋白，纯度相当于一般商品，即1毫克蛋 白的产品能抑制近1毫克的胰蛋白酶，比活力为10, 000 BAEE单位/毫克蛋白， 并含有少量抑制胰凝乳蛋白酶的抑制剂（Ch

12、ymotrypsin inhibitor ）每毫克产品 能抑制a-胰凝乳蛋白酶的量小于0.03毫克。/收集的部分纯化的卵类粘蛋白可直接用于活性和蛋白质浓度测定，一般情况下，由于实验课时限制，洗脱流速较快，导致洗脱体积过大，需要蔗糖浓缩到 2-3ml左右，再对水透析，最大体积不要超过 5ml,活力测定前，要对0.1mol/L pH8.0 PB缓冲液透析，透析后测量体积，为纯化后类粘蛋白的总体积。（三）酶活力测定：3.1 BAEE 法3.1.1 胰蛋白酶的活力测定：以苯甲酰L一精氨酸乙酯（benzoyl L-arginineethyl ejtev 简称BAEE为底物，用紫外吸收法测定。方法如下：取

13、2个石英比色池（带盖，光程为 1厘米），分别加入25度预热的2.8毫升 BAEE-0.05M pH 8.0 Tris-HcL 缓冲液（含氯化钙），然后想一个池中加入 0.2毫 升0.05M Tris-HcL缓冲液，混合，作为空白对照，调零。另一池加入 0.2毫升 酶液（用量一般为10微克蛋白的结晶酶），立即混匀并计时，于253nm处测其光 密度（增加），每隔半分钟读一次数，共 35分钟。若 OD价钟0.400,则酶 液需要稀释或减量。根据时间一光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔与相应光密度值变化 （?OD,按一下公式计算胰蛋白酶的活力单位和比活力。酶活力单位（BAE即位）=?OD t/

14、t*0.001、比活力二酶活力单位/毫克蛋白质=?OD t/t*1000/ e *t*0.001式中？OD t/t为任选的时间隔（分）内光密度值的变化（增加），e为测定时所 用酶蛋白量（微克）；1000为酶蛋白由微克换算成毫克的转换值；0.001为光密 度增加0.001定为1个BAEE舌力单位的常数。比活力二酶活力单位数/毫克蛋白质=?OD t*1000/ e *t*0.0013.1.2 卵类粘蛋白抑制活性测量：抑制1个胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）所需卵类粘蛋白量定为抑制剂的一个活力单位。 将卵类粘蛋白和结晶胰蛋白酶按一 定比例相互混合，（卵类蛋白量不能超过胰蛋白酶量，一般以 1: 2较适

15、合，具体 视卵类粘蛋白的纯度而异）加入适量的 0.05M pH 6.0 Tris-HcL-NaCL 缓冲液在 25c保温10分钟左右，使酶与抑制剂充分结合。然后取适量混合液（相当于原 胰蛋白酶10微克左右）按上述方法测出胰蛋白酶活力，由它减去剩余酶活力， 即为被抑制的胰蛋白酶活力，也就是卵类粘蛋白的抑制活力。抑制胰凝乳蛋白酶 的活力测定方法与上述测定抑制胰蛋白酶的活力相似，仅是用胰凝乳蛋白酶、 ATEE弋替。3.2 Folin-酚法测定胰蛋白酶的酶活力及卵类粘蛋白的抑制活力/测胰蛋白酶的酶活原理：蛋白酶能催化蛋白质的肽键水解，生成游离氨基酸或小肽。如果蛋白酶的活 力大则水解的肽键就多，生成的氢

16、基酸也愈多。测定蛋白酶活力可以采用福林一 酚试剂与蛋白质水解出来的酪氨酸作用生成蓝色物，在分光光度计上测蓝色物质 的ODe,从酪氨酸标准曲线上查出酪氨酸产物的量，再根据酶活力计算公式计 算酶活力的大小。测定粘蛋白抑制活力原理：由于卵类粘蛋白在碱性条件先能可逆地与胰蛋白酶结合，抑制其活性，抑制比为1摩尔对1摩尔，因此首先测定出一定量的胰蛋白酶活力单位，再以一定量的卵类粘蛋白与胰蛋白酶一起保温一定时间， 使卵类粘蛋白充分与胰蛋白酶相互 作用，并抑制胰蛋白酶活性，然后测定胰蛋白酶的剩余活力，用胰蛋白酶活力减 去胰蛋白酶的剩余活力，就是卵类粘蛋白的抑制活力。3.2.1 酪氨酸标准曲线绘制表1酪氨酸标准

17、曲线加样表管号1#2#3#4#5#6#标准酪氨酸（ml）00.20.40.60.81.0尢离子水（ml）1.00.80.60.40.20酪氨酸浓度（ug/ml）020406080 1000.4M NazCO (ml)555555Folin乙试剂（ml）11111、140c水浴 20min 后，测定 A580nmA680nm3.2.2粘蛋白对胰蛋白酶的抑制使粗品和纯品在pH8.0条件下，充分与胰蛋白酶结合，抑制其活性。1 和 1 :0.5ml 胰蛋白酶溶液（trypsin,T ）浓度 0.4mg/ml+0.5ml pH 8.0 PBbuffer;2 和 2 ： 0.5ml 粘蛋白粗品（crude

18、,C ） +0.5mltrypsin（0.4mg/ml）,40 度保温 10min;3 和 3: 0.5ml 粘蛋白粗品（purfied,P ） +0.5mltrypsin（0.4mg/ml）,40 度保温 10min;经过抑制之后，按表2所列顺序加样。3.2.3 胰酶及粘蛋白抑制后对酪蛋白底物的水解表2胰蛋白酶及粘蛋白抑制后水解酪蛋白底物加样表管号11223 /3样品(ml)1.01.01.01.01.01.040 c 预热 5min /0.4M三氯乙 酸（ml）2.0 02.0 /02.002%各蛋 白1.01.01.01.01.01.040c继续水浴10min,0.4M三氯乙 酸(ml)

19、0 /2.00 2.002.0/7cm滤纸过滤，得酶促反应滤液表2中管号的含义：1:胰蛋白酶水解底物对照，1:胰蛋白酶水解底物；2:粘蛋白粗品抑制后胰酶水 解底物对照，2:粘蛋白粗品抑制后胰酶水解底物；3:粘蛋白纯品抑制后胰酶水 解底物对照，3:粘蛋白纯品抑制后胰酶水解底物。3.2.4 各管酶促反应滤液与Folin-酚试剂反应表3上述各管酶促反应滤液与Folin-酚试剂反应加样表112233表2滤液 (ml)1.01.01.01.01.01.00.4MNa2CO (ml)5.05.05.05.05.05.0Folin 乙试剂(ml)1.01.01.01.01.01.040 c 水浴 20min

20、 后，测定 A680nm/A680nm0?0?0?活力及剩 余单位数 (U)x ?X?X粘蛋白抑 制活力?3.2.5 酶活力单位定义及计算公式:40度下，每min每mL酶液水解干酪素产生1微克酪氨酸所需的酶量，定义 为一个酶活力单位U。计算公式：酶活力单位=OD4+10 XnXk、OD : 1ml酶促反应液测得的OD6804 :酶促反应体积；10 :酶促反应时间；n :酶液的稀释倍数（本实验中n为1,各管内含有的胰蛋白酶均为1mL,2mg/ml 的胰蛋白酶溶液）/k : 1个ODfi相当于酪氨酸的微克数（对应于每一台分光光度计应有一个不 同的标准曲线，因此k值也不同，但k值的范围在90.5-9

21、1.5之间，本实验为节 省时间取k值为91）注意事项：1mL 0.2mg/mL胰蛋白酶溶液，在实验条件下水解酪蛋白产生的酪氨酸，与Folin-酚试剂反应，产物的OD正好在标准曲线范围内，一般在 0.2左右，计 算出1mL胰蛋白酶的活力单位数。纯化总表步骤总体积/ml总蛋白/mg总活力/U比活力U/mg收率纯化倍 数丙酮-TCA粗提100DEAE-Cellulose-52（四）蛋白质浓度测定见附录（五）纯度鉴定及分子量测定见附录二（六）注意事项：（七）思考题：附录一：Folin-酚法测定蛋白质浓度 一、测所需试剂：1、0.1M NaOH称取0.4g氢氧化钠，无离子水定容至 100mL2、标准蛋白

22、质溶液：称取预先经凯氏定氮法测定蛋白含量（含氮量 89%,含水量 4%的酪蛋白292g,用少量0.1M氢氧化钠湿润成糊状，无离子水定容500mL500 N g/mL）。3、Folin-试剂 /A、试剂甲：（1）: 4%酸纳（NaCO）溶液：称取碳酸钠120g,无离子水定容至3000mL （2）: 0.2N氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠 24g,无离子水定容至3000mL （3） 1酸铜溶液：称取硫酸铜2g,无离子水定容至200mL（4） 2%酉石酸钾钠溶液：称取洒石酸钾钠 4g,无离子水定容至200mL 临用前将：（1）与（2）等体积配制碳酸钠一氢氧化钠无离子水定容至3000mL溶液，（A）（3）

23、与（4）等体积配制成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液，（B）然后将A、B两种试剂按50: 1的比例混合，即成Folin-酚试剂甲。B试剂乙:称鸨酸钠（NaWO- 2HQ 25g、铝酸钠（NaMoQ 2H2O） 6.25g 置 500mLs 口回流装置内，加蒸储水175mL 85麻酸12.5mL和浓盐酸25mL充分混匀，使其溶 解。小火加热，回流10小时（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液爆沸），再加入 硫酸锂（LiSOQ 37.5g,蒸储水12.5mL及滨水数滴。在通风橱中开口煮沸15min, 以除去多余的澳。冷却后定容至250mL过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，此液 应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶

24、中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用 过久，颜色由黄变绿，可加几滴液澳，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（ 1moll/L左 右），以酚肽为指示剂，当溶液颜色由红一紫红一紫灰一墨绿时即为滴定终点/ 该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。 二、操作步骤：/（1）标准曲线的绘制取8支试管，分两组按下表平行操作。/1#2#3#4#5#6#标准酪蛋白溶液/mL00.20.40.60.81.0蒸储水/mL1.0/0.80.7 0.60.50.4酪蛋白浓度(小 g/mL)0100200300400500待测试样品

25、/mL000000Folin-酚甲试剂/mL5.05.05.05.05.05.0/混匀，于25c水浴10分钟Folin-酚乙试剂/mL0.50.50.50.50.50.5迅速混匀，于25c水浴30分钟，以1#做对照，测A640Ag40(2)待测样品的测定：取两支试管分别以待测样品1.0ml ,替代标准蛋白溶液，其他步骤与标准曲线相 同。147#8#待测试样品/mL00Folin-酚甲试剂/mL5.05.0/混匀，于25c水浴10分钟Folin-酚乙试剂/mL / 0.50.5/迅速混匀，于25c水浴30分钟，以1#做对照，测A640A640根据样品的A640和标准曲线公式，计算样品的蛋白质浓度

26、。附录二：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量一、实验目的1 . 了解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2 .掌握电泳实验操作规程3 .用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定蛋白质分子量二、实验原理SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快 速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDSf蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的 溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯 酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS

27、-PAGES易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。三、实验材料和试剂1) .胶母液：30%Acr-0.8%Bis贮液，Acr 150 g,Bis 4 g ,重蒸水溶解，定容至 500 mL。棕色 瓶中4c保存，可放置1个月左右。/2) .10%过硫酸俊(AP): 1 g APS溶于10 mL蒸储水，4c贮存，可用一周。 /3) .pH8.9Tris-HCI 缓冲Tris 92 g,1 mol/L HCI 120 mL,TEMED 2.5 ml,10% SDS 3ml 加蒸 储水溶解，定容到 500 mL。/4) .pH6.7Tris-HCI 缓冲全夜：30 g Tri

28、s, 1 mol/L HCl 240 mL, TEMED 2.5ml,10% SDS 3ml, 加蒸 储水溶解，定容到 500 mL。/5) .pH 8.3 Tris-Gly 电极缓冲液：6.0 g Tris, 28.8 g Gly , 1 g SDS,加蒸储水溶解, 定容到 1000 mL o6) .样品液：pH 6.7缓冲液25 mL,甘油10 mL ,10% SDS 10 mL ,前基乙醇1 mL ,加澳酚 蓝少许，定容到 50 mL。/8) . 0.05%考马斯亮蓝 R250染色液：2.5 g考马斯亮蓝，甲醇 250 ml,冰乙酸50 ml,水定 容至U 500 mL。9) .脱色液：

29、7%乙酸溶液。(70 ml冰乙酸，无离子水定容至 1000 ml。四、器材垂直板电泳槽、凝胶模(135X 100X 1.0mm)样品梳、直流稳压电源，以上产品皆为北 京六一仪器厂生产。吸量管(1, 5, 10mL);烧杯( 25, 50, 100mL);细长头滴管；1mL 注射器及6号长针头；微量进样器(/10, 50pL);真空干燥器；培养皿(直径 120mm);玻 璃板(13 x 13cm);玻璃纸(18 x 18c)四、实验步骤1 .配制SDS5丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂2 .电泳/ 根据厂家说明书安装电泳槽的玻璃板。配胶：确定所需凝胶溶液体积，在一小烧杯中按表1从上到下的顺序配制分离胶

30、溶液。一旦加入TEMED马上开始聚合，故应立即快速混匀/迅速将凝 胶溶液灌注在玻璃板的缝隙内。一般地，使凝胶液面达玻璃板垂直高度的2/3, 上面的1/3留待灌注浓缩胶。最后用微量进样器将100uL水加在胶的液面上，约 2-3mm厚，以隔绝空气中的氧气，解除对凝胶聚合作用的抑制。表1 10%分离胶的配制 总体积5mL7mL30%交母液(mL)1.652.3pH8.9buffer含 SDS、TEMED(mL1.25)1.75尢离子水(mL)2.12.95/10%APS(uL) 4060 /(3)待分离胶聚合完全后(约30分钟)，倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。(4)制备浓缩胶：按表2给出的数据，

31、在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓 度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED马上开始聚合。在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，注 意梳子的正反面，小心避免混入气泡，再将剩余的浓缩胶溶液填满梳子之间的空 隙，室温放置待凝。表2 3.6%浓缩胶的配置总体积2mL30%交母液（mL）0.24pH8.9buffer含 SDS、TEMED(mL) /LZ 0.5尢离子水（mL） /0.910%APS(uL)30（5）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，将待电泳分析的样品（本实验 样品为鸡卵类粘蛋白粗品、鸡卵类粘蛋白纯品、标准蛋白质Marker）。每一组用一块凝胶，凝胶中间的点样孔点 Marker和BSA左侧点样孔点粘蛋白 粗品，右侧点样孔点粘蛋白纯品。分别取 1、2支1.5mL离心管，先各加入粘蛋 白粗品和纯品150uL,按样品：样品处理液（体积比）=1:1的比例加入样品处理 液150uL,混匀，在100c水浴加热3min,以使蛋白质充分变性并与 SDS吉合, 加样顺序及加样量见表3。注意，Marker和BSA两管也和样品同时沸水浴3min表三点样顺序及点样量点样孔12345678910样品粗品粗品粗品粗品MarkerBSA纯品纯品纯品纯品点样量（uL）15105210205101520（6）浓缩胶聚合完全后（30