生物化学讲义(1)(2)

1、第一章 绪论（2学时）一、生物化学研究的主要内容生物分子是生物体和生命现象的结构基础和功能基础，是生物化学研究的基本对象。生物分子和结构与功能：探讨生物体的物质组成以及分子结构、性质和功能。物质代谢及其调节：物质代谢的规律、能量转化及其调节控制。二、生物化学的定义简单地说生物化学就是研究生命现象的化学本质。具体来说生物化学是用物理的、化学的原理与技术，从分子水平来研究生物体的化学组成、生命活动的基本规律及调节方式，从而阐述生命现象化学本质的一门科学。三、生物化学的分类根据研究对象不同，生物化学可分为： 植物生物化学动物生物化学微生物生物化学和病毒生物化学。根据研究的目的不一样，生化又可分为：农

2、业生物化学工业生物化学医用生物化学和药物生物化学。四、生物化学发展简史 起源于18世纪晚期、发展于19世纪、直到20世纪初始成独立学科。依据发展过程及其特点可大致划分为： 起始阶段 - 叙述生化 (descriptive) 快速发展阶段 - 动态生化 (dynamic) 分子生物学崛起 - 机能生化 (functional)第二章 蛋白质（10学时）第一节 通论蛋白质（protein）在生物体内具有广泛和重要的生理功能，它不仅是各器官、组织的主要化学组成，且生命活动中各种生理功能的完成大多是通过蛋白质来实现的，而且蛋白质在其中还起着关键的作用，所以蛋白质是生物化学学科中传统、基础的内容，在分子

3、生物学学科中又是发展最快、最重要的部分之一，protein一词就是来自1938年Jons J Berzelius创造的希腊单词protios，意为第一或最重要的意思。一、蛋白质的概念蛋白质（protein，简写pro): 是由20种L-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有稳定构象和一定生物功能的生物大分子。二、蛋白质的分类三、蛋白质的元素组成1.共有的元素有C、H、O、N，其次S、稀有P等2.其中N元素的含量相对恒定，占13%19%，平均为16%，因此通过样品中含氮量的测定，乘以6.25，即可推算出其中蛋白质的含量（凯氏定氮法）。四、蛋白质的生物学功能.蛋白质是生命的表征，哪里

4、有生命活动哪里就有蛋白质1.酶：作为酶的化学本质，温和、快速、专一，任何生命活动之必须，酶的另一化学本质是RNA，不过它比蛋白质差远了，种类、速度、数量。2.免疫系统：防御系统，抗原（进入“体内”的生物大分子和有机体），发炎。细胞免疫：T细胞本身，分化，脓细胞。体液免疫：B细胞，释放抗体，导弹，免疫球蛋白（Ig）。3.肌肉：肌肉的伸张和收缩靠的是肌动蛋白和肌球蛋白互动的结果。4.运输和储存氧气：Hb和Mb。5.激素：含氮类激素，固醇类激素。6.基因表达调节：操纵子学说，阻遏蛋白。7.生长因子：EGF（表皮生长因子），NGF（神经生长因子），促使细胞分裂。8.信息接收：激素的受体，糖蛋白，G蛋白

5、。9.结构成分：胶原蛋白（肌腱、筋），角蛋白（头发、指甲），膜蛋白等。生物体就是蛋白质堆积而成，人的长相也是由蛋白质决定的。10.精神、意识方面：记忆、痛苦、感情靠的是蛋白质的构象变化，蛋白质的构象分类是目前热门课题。 第二节 氨基酸（amino acids）-蛋白质组成单位氨基酸（amino acid, aa)：蛋白质的基本组成单位，是含氨基的羧酸。是羧酸分子中C上的一个H被氨基取代而成的化合物。一、氨基酸的一般结构特征大分子蛋白质的基本组成单位或构件分子（building-block molecule）是氨基酸（amino acid，AA）。在种类上，虽然自然界中存在着300多种氨基酸，但

6、构成蛋白质的只有20种氨基酸，且都是L-氨基酸，在蛋白质生物合成时它们受遗传密码控制。另外,组成蛋白质的氨基酸，不存在种族差异和个体差异。在20种氨基酸中，除甘氨酸不具有不对称碳原子和脯氨酸是亚氨基酸外，其余均为-氨基酸。氨基酸分子的结构通式为：氨基酸的构型：自然选择L-型，D-型氨基酸没有营养价值，仅存在于缬氨霉素、短杆菌肽等极少数寡肽之中，没有在蛋白质中发现。二、氨基酸的分类和结构1.按侧链R基的极性<1>极性氨基酸：亲水氨基酸：溶解性较好，酸性氨基酸、碱性氨基酸、含巯基、羟基、酰胺基的氨基酸，Glu、Asp、Arg、Lys、His、Cys、Ser、Thr、Tyr、Gln、As

7、n。<2>非极性氨基酸：疏水氨基酸：溶解性较差，具有烷烃链、甲硫基、吲哚基等的氨基酸，Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Pro、Met、Trp、Phe。20种基本氨基酸的表示方法有下列几种：（1）中文名：X（X）氨酸，如甘氨酸、半胱氨酸。20种要会背。（2）英文名：3字名，如Gly、Cys等，20种要会背。（3）按顺序演示，记忆技巧。Ala Arg Asp Asn Cys Glu Gln Gly His Ile丙 精 天 天冬酰氨 半 谷

8、 谷氨酰氨 甘 组 异亮Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val亮 赖 甲硫 苯丙 脯 丝 苏 色 酪 缬氨基酸的具体结构：20种全部记住，仅注意R。讲解顺序：甘Gly（最特殊，唯一无旋光性）、丙Ala（顾名思义）、苯丙Phe（顾名思义）。酪Tyr（有-苯酚基）、半胱Cys（-巯基）、丝Ser（-羟基）、苏Thr（-羟基）、天冬Asp（酸性

9、氨基酸，-羧基）、天冬酰胺Asn（-酰胺）、色Trp（-吲哚基）、组His（-咪唑基）。谷Glu（酸性氨基酸，-羧基）、谷氨酰胺Gln（-酰胺）、甲硫Met（-甲硫基）。精Arg（-胍基）。赖Lys（碱性氨基酸，-氨基）。缬Val、亮Leu、异亮Ile：都是烷烃链。脯Pro（亚氨基）。2.按侧链R基的结构<1>脂肪族氨基酸：酸性氨基酸（2羧基1氨基：Glu、Asp），碱性氨基酸（2氨基1羧基：Arg、Lys），中性氨基酸（氨基羧基各一：很多）<2>芳香族氨基酸：含苯环：Phe、Tyr<3>杂环氨基酸： His（也是碱性氨基酸）、Pro、Trp3.按

10、氨基酸营养价值<1>必需氨基酸：人和哺乳动物不可缺少但又不能合成的氨基酸，只能从食物中补充，共有8种：Leu、Lys、Met、Phe、Ile、Trp、Thr、Val<2>半必需氨基酸：人和哺乳动物虽然能够合成，但数量远远达不到机体的需求，尤其是在胚胎发育以及婴幼儿期间，基本上也是由食物中补充，只有2种：Arg、His。有时也不分必需和半必需，统称必需氨基酸，这样就共有10种。<3>非必需氨基酸：人和哺乳动物能够合成，能满足机体需求的氨基酸，其余10种4.非基本氨基酸<1>氨基酸的衍生物：蛋白质分子中尚含有一些经修饰的氨基酸，并无遗传密码编码，它们

11、往往是在蛋白质生物合成后，由其中相应氨基酸经加工修饰生成。如胱氨酸是由2个半胱氨酸脱氢氧化生成，含有二硫键，存在于部分蛋白质分子中；而羟赖氨酸与羟脯氨酸来自蛋白质中赖氨酸和脯氨酸的羟化，主要存在于胶原蛋白分子中，它与胶原蛋白分子结构的稳定与功能均有关；一些凝血因子分子中含有羧基谷氨酸，也来自蛋白质分子中谷氨酸的羧化，且与其凝血活性密切有关；而一些酶蛋白分子中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸羟基，还可与磷酸结合被磷酸化等，更与酶活性的调节功能密切相关。<2>非蛋白氨基酸：仅游离存在，瓜氨酸、鸟氨酸、-丙氨酸<3>D-氨基酸：缬氨霉素、短杆菌肽中含有。三、氨基酸的性质1.物理性质&

12、lt;1>溶解性：溶解于水，特别是稀酸稀碱溶液，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。<2>紫外吸收：有共轭双键的物质都具有紫外吸收，在20种基本aa中，有4种是具有共轭双键的，Trp、Tyr、Phe、His，其中His只有2个双键共轭，紫外吸收比较弱，Trp、Tyr、Phe均有3个双键共轭，紫外吸收较强，其中Trp的紫外吸收最厉害，是蛋白质紫外吸收特性的最大贡献者。2.化学性质<1>两性解离和等电点：氨基酸是个两性电解质，既可进行酸解离也可进行碱解离，用解离方程式表示，这样，氨基酸在水溶液中就可能带电，+或-，以及呈电中性，到底是什么情况，完全由溶液的PH值来决定。等电点

13、：如果调节溶液的PH值使得氨基酸所带正负电荷相等，即净电荷为零时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点。PI是氨基酸的重要常数之一，它的意义在于，物质在PI处的溶解度最小，是分离纯化物质的重要手段。<2>等电点的计算：对于所有的R基团不解离的氨基酸而言（即解离只发生在-羧基和-氨基上），计算起来非常简单：PI（PK1+PK2）/2若是碰到R基团也解离的，氨基酸就有了多级解离，这个公式就不好用了，比如Lys、Glu等。在这种情况下可以按下面的步骤来计算： 一氨基二羧基氨基酸,其公式为: pI=(pK1+Pk2)/2二氨基一羧基氨基酸,其公式为: pI=(pK2+pK3)/2氨基酸等电点范围

14、 中性aa:PI 5.06.5 酸性aa:PI 2.73.2 碱性aa:PI 9.510.7如果给不同的aa溶液通以电流: PH>PI aa- 向阳极移动 PH<PI aa+ 向阴极移动 PH=PI aa为两性离子 不发生电泳在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多。在电场中移动愈快。因此,带电颗粒的迁移速度与其所带净电荷多少,分子大小,分子形状有关.<3>紫外吸收特征<4>氨基酸的重要化学反应-氨基和-羧基共同参加的反应（1）茚三酮反应：Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。 (2)成肽反应-氨基参加的反应（1）DNFB（二硝基氟苯，Sa

15、nger试剂），蛋白质N端测定一级结构分析。（2）PITC（苯异硫氰酸酯，Edman试剂）蛋白质N端测定一级结构分析。（3）甲醛滴定aa含量：（封闭氨基）。-羧基参加的反应侧链反应(1)黄色反应-芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）芳香族氨基酸遇浓硝酸生成黄色硝基苯衍生物，在碱性溶液中，进一步形成深橙色的硝醌酸钠。(2)乙醛酸反应-色氨酸特有反应色氨酸在浓硫酸中与乙醛酸反应生成红紫色物质。(3) 福林(Folin)反应-酪氨酸酪氨酸在碱性条件下与Folin试剂中的磷钼酸磷钨酸反应生成蓝色化合物。第三节 蛋白质的结构一.肽与肽键<1>肽键（peptide bond）是蛋白质分子中

16、的主要共价键，性质比较稳定。它虽是单键，但具有部分双键的性质，难以自由旋转而有一定的刚性，因此形成肽键平面（图23），则包括连接肽键两端的CO、和2个C共6个原子的空间位置处在一个相对接近的平面上，而相邻2个氨基酸的侧链R又形成反式构型，从而形成肽键与肽链复杂的空间结构。<2>肽（peptide）是氨基酸通过肽键相连的化合物，蛋白质不完全水解的产物也是肽。肽按其组成的氨基酸数目为2个、3个和4个等不同而分别称为二肽、三肽和四肽等，一般含10个以下氨基酸组成的称寡肽（oligopeptide），由10个以上氨基酸组成的称多肽（polypeptide），它们都简称为肽。肽链中的氨基酸已

17、不是游离的氨基酸分子，因为其氨基和羧基在生成肽键中都被结合掉了，因此多肽和蛋白质分子中的氨基酸均称为氨基酸残基（amino acid residue）。多肽有开链肽和环状肽。在人体内主要是开链肽。开链肽具有一个游离的氨基末端和一个游离的羧基末端，分别保留有游离的氨基和羧基，故又称为多肽链的N端（氨基端）和C端（羧基端），书写时一般将N端写在分子的左边，并以此开始对多肽分子中的氨基酸残基依次编号，而将肽链的C端写在分子的右边。写法和读法：规定书写方法为N端C端，例如：Ala-Gly-Phe，读作：丙氨酰甘氨酰苯丙氨酸。<3>肽的性质1.酸碱性：肽至少有一个游离的氨基和游离的羧基，也是

18、两性化合物，至少有2级解离，通常都有多级解离。因此，肽在水溶液中也能够带电，也有自己的等电点PI，其计算与测定完全同氨基酸的。例如：谷胱甘肽，Glu-Cys-Gly，注意Glu-Cys之间的肽键（-，而不是正常的-），各解离基团的PK值，PI（2.13+2.34）/22.235，很酸。2.双缩脲反应：双缩脲（相似于三肽，即2个肽键）、碱性铜离子、紫红色化合物。凡大于三肽的肽都能发生此反应，2肽不行。<4>肽的实例1.谷胱甘肽：注意Glu与Cys的连接（-，而不是正常的-），还原型GSH和氧化型GSSG，主要作用是还原剂，消除体内的自由基。2.催产素和加压素：9肽或环8肽，都是脑垂体

19、后叶激素，都有升血压、抗利尿、刺激子宫收缩、排乳的作用，催产素促进遗忘，加压素增强记忆。二、蛋白质分子结构及其规律性蛋白质是大分子化合物，一般由一条肽链、上百个氨基酸，即成千上万个原子组成，分为一、二、三、四4级、四个不同的层次（表25），以便进行深入研究，其中二、三、四级均属于蛋白质的三维空间结构（three-dimensional structure，3D）或构象（conformation）。随着研究的深入，现在在蛋白质二级和三级结构之间，又增加了一些超二级结构和结构域(domain)。（一）蛋白质的一级结构（primary structure）蛋白质的一级结构，专指多肽链中氨基酸（残基）

20、的排列的序列（sequence）。若蛋白质分子中含有二硫键，一级结构也包括生成二硫键的半胱氨酸残基位置。一级结构就是指蛋白质分子中由共价肽键相连的基本分子结构。不同的蛋白质，首先具有不同的一级结构，因此一级结构是区别不同蛋白质最基本、最重要的标志之一。蛋白质一级结构的重要性，首先是由于其序列中不同氨基酸侧链R的大小、性质不同，决定着肽链折叠盘曲形成不同的空间结构和功能。1.一级结构：即蛋白质的共价结构或平面结构，核心内容就是aa的排列顺序，它的改变涉及到蛋白质共价键的破坏和重建。一级结构的全部内容包括：肽链的个数、aa的顺序、二硫键的位置、非aa成分。2.蛋白质一级结构的测定间接法：通过测定蛋

21、白质之基因的核苷酸顺序，用遗传密码来推断aa的顺序。这是因为核苷酸的测序比蛋白质的测序工作要更方便、更准确。直接法：用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测定出aa顺序。<1>第一步：前期准备分离纯化蛋白质：纯度要达到97以上才能分析准确。蛋白质分子量的测定：渗透压法、凝胶电泳法（聚丙烯酰胺、SDS）*、凝胶过滤法*、超离心法*等aa组成的测定：氨基酸自动分析仪肽链拆分：非共价键的如氢键、离子键、疏水键、范德华力4种，可用尿素或盐酸胍等有机溶液来拆分。共价键的仅二硫键1种，可用巯基乙醇、碘代乙酸、过甲酸来拆分。<2>第二步：肽链的端点测定N端测定：Sanger法，DNFBD

22、NP-肽水解乙醚萃取层析鉴定 Edman法，PITCPTC-肽PTH-aa层析鉴定C端测定：肼解法，唯有C端aa与众不同，酰肼化合物与游离aa，再通过Sanger法来鉴定。Asn、Gln、Cys、Arg将被肼破坏，不能分析。 羧肽酶法： 羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基羧肽酶B：仅Arg、Lys羧肽酶C：所有的氨基酸残基<3>每条肽链aa顺序的测定：aa顺序自动分析仪只能准确测定50aa以下的肽链，而一般的蛋白质都含有100以上的aa残基，所以，事先要将蛋白质打断成多肽甚至寡肽，再上机分析，而且要2套以上，便于以后拼接。举例：156987351256984

23、52315 698735 125 69845 231569 873512569 84523常用的工具酶和特异性试剂有：胰蛋白酶：仅作用于Arg、Lys的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。糜蛋白酶：仅作用于含苯环的氨基酸的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。Trp、Tyr、PheCNBr：仅作用于Met的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。拼接：将2套多肽的aa顺序对照拼接， <4>第四步：二硫键位置的确定：包括链内和链间二硫键的位置，用对角线电泳来测。在肽链未拆分的情况下用胃蛋白酶水解之，可以得到被二硫键连着的多肽产物。先进行第一向电泳，将产物分开。再用过甲酸、碘代乙酸、巯

24、基乙醇处理，将二硫键打断。最后进行第二向电泳，条件与第一向电泳完全相同。选取偏离对角线的样品（多肽或寡肽），它们就是含二硫键的片段，上机测aa顺序，根据已测出的蛋白质的aa顺序，把这些片段进行定位，就能找到二硫键的位置。3.蛋白质一级结构测定的意义<1>分子进化：将不同生物的同源蛋白质的一级结构进行比较，以人的为最高级，从而确定其它物种的进化程度，也可以制成进化树，由于这是由数据决定的，因此比形态上确定的进化更加科学和精确。<2>证明了一个理论，即蛋白质的一级结构决定高级结构，最终决定蛋白质的功能。<3>疾病的分子生物学：镰刀型贫血症的内因是血红蛋白的6Va

25、l，正常的血红蛋白的6Glu4.1954年英国生化学家Sanger报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质。弗雷德里克·桑格，英国生物化学家，曾经在1958年及1980年两度获得诺贝尔化学奖：1955年确定了牛胰岛素结构而获得1958年度奖；设计出用P32放射性标记法结合双向电泳分离技术测定DNA分子中的核苷酸排列顺序的方法而分享1980年度奖。1965年9月17日，中国首次人工合成胰岛素。这也是世界上第一个蛋白质的全合成。（二）蛋白质的二级结构（secondary structure）蛋白质的二级结构为主链构象，不涉及侧链构象。主链基本构象都是以酰胺平面（或称肽键

26、平面、肽单元）为基本结构单位。蛋白质分子的空间结构有一些共同的规律可遵循，其中二级结构主要是周期性出现的有规则的-螺旋、-折叠、-转角、和无规卷曲等几种二级结构单元，且这些有序的二级结构单元，主要是靠氢键等非共价键来维持其空间结构的相对稳定的。1.二级结构概论<1>二级结构的定义：肽链主干在空间的走向。主干指的是肽平面与-C构成的链子。<2>二级结构的内容：空间走向以及维持这种走向的力量：氢键和R基团的影响。<3>二级结构的数学描述：角：肽平面绕N-C单键旋转的角度；角：肽平面绕C-C羧基单键旋转的角度。2.二级结构的常见类型Pauling的贡献：莱纳斯&#

27、183;鲍林 是著名的量子化学家，他在化学的多个领域都有过重大贡献。曾两次荣获诺贝尔奖金（1954年化学奖， 1962年和平奖），有很高的国际声誉。 X光衍射法是研究蛋白质构象的最好技术。<1>-螺旋（-helix）：蛋白质中最常见,最典型,含量最丰富的二级结构单元.由1950年Pauling等人提出的.其基本特征是：-螺旋即像弹簧一样的螺旋，-螺旋为右手螺旋。侧链伸向螺旋外侧。每一圈含有3.6个aa残基（或肽平面），每一圈高（螺距）0.54nm，即每一个aa残基上升0.15nm，旋转了100o。维持-右手螺旋的力量是链内氢键，它由第1个氨基酸肽键上CO，隔三个氨基酸残基，与第5个

28、氨基酸肽键上NH形成氢键，其间包括13个原子，故又称3.613螺旋，且氢键方向与螺旋长轴基本平行。影响a-螺旋形成的因素：破坏者Pro，该处折断，因为亚氨基不能形成氢键；不稳定者酸性aa、碱性aa，形成静电斥力，若一段肽链有多个碱性(酸性)氨基酸残基相邻, 防碍螺旋的形成（Glu、Asp、Arg、Lys）；太大R基团、太小R基团，产生空间位阻，防碍螺旋的形成（Gly、Ile、Asn、Leu）。分布：毛发中的-角蛋白，例如头发中的-角蛋白。<2>-折叠：是肽链中比较伸展的空间结构，其中肽键平面接近平行、但略呈锯齿状或扇形。维持-折叠的力量：链间的氢键，它由25个肽段片层之间经CO与N

29、H间形成的氢键系，但氢键方向与肽链长轴方向相垂直，且反平行方式排列在热力学上最为稳定。-折叠有平行式和反平行式两种。平行式：两条链的走向相同；反平行式：两条链的走向相反。反平行式的-折叠比平行式的更稳定结构特征：（1）由若干条肽段或肽链平行或反平 行排列组成片状结构；（2）主链骨架伸展呈锯齿状；（3）反平行中重复周期(肽链同侧两个相邻的同一基团之间的距离)为0.70nm,而平行中为0.65nm.（4）借相邻主链之间的链间氢键维系。一条肽链回折后就可形成两条走向相反肽段，就可以形成反平行式的-折叠，-折叠不限于两条肽链之间，多条肽链可以形成很宽的-折叠片层，片层与片层之间以范德华力相互作用，形成

30、厚厚的垫子。-右手螺旋与-折叠相比更具弹性，不易拉断，-折叠易拉断，-右手螺旋经加热后可变成-折叠，长度增加，毛衣越洗越长也是这种变化。<3>（turn，T），指肽链出现180º左右转向回折时的“U”形有规律的二级结构单元。这个结构包括的长度为4个aa残基，其中的第三个为Gly，稳定该结构的力量是第一和第四个aa残基之间形成的氢键。此结构广泛存在球状蛋白中。甘氨酸和脯氨酸经常出现在-转角序列中：甘氨酸缺少侧链(只有一个H),在-转角中能很好地调整其他残基的空间阻碍,脯氨酸具有刚性的吡咯环,在一定程度上迫使-转角形成.促使多肽链自身回折.<5>无规卷曲（rand

31、on coil）：是指各种蛋白质分子中彼此各不相同、没有共同规律可遵循的那些肽段空间结构，它是蛋白质分子中一系列无序构象的总称，也可以说是各种蛋白质分子中的特征性二级结构。因为在蛋白质分子中，并不是所有肽段都形成有序的-螺旋、-片层、-转角等二级结构的，而是有相当部分的肽段，其二级结构在各蛋白质分子间彼此并不相似，无共同规律可遵循，它也普遍存在于各种天然蛋白质分子中，同时也是蛋白质分子结构和功能的重要组成部分。（三）超二级结构（super secondary structure）和结构域近年来随着蛋白质结构与功能研究的深入，发现不少蛋白质分子中的一些二级结构单元，往往有规则地聚集在一起形成全由

32、-螺旋、全由-片层或-螺旋与-片层混合、均有的超二级结构基本形式，具体说，形成相对稳定的、2和T等超二级结构（图212）又称模体(motif)或模序。具有调控作用的转录因子蛋白质中，就有2和T超二级结构存在。且单个或多个超二级结构，尚可进一步集结起来，形成在蛋白质分子空间结构中明显可区分的区域，称结构域（图213），它们分别又是蛋白质分子中的一个个功能单位，故不严格地又称之为功能域。蛋白质的结构域一般由40400个氨基酸残基组成。（四）蛋白质的三级结构（tertiary structure）蛋白质的三级结构是指整条多肽链中所有氨基酸残基，包括相距甚远的氨基酸残基主链和侧链所形成的全部分子结构。

33、因此有些在一级结构上相距甚远的氨基酸残基，经肽链折叠在空间结构上可以非常接近。如果蛋白质是单条肽链，则三级结构就是它的最高级结构，这是蛋白质分子最显著的特征之一。三级结构由二硫键和次级键（氢键、疏水键、离子键、范德华力）维持。肽链折叠卷曲形成的球状、椭圆形等三级结构蛋白质分子，往往形成一个亲水的分子表面和一个疏水的分子内核，靠分子内部疏水键和氢键等来维持其空间结构的相对稳定。有些蛋白质分子的亲水表面上也常有一些疏水微区，或在分子表面形成一些形态各异的“沟”、“槽”或“洞穴”等结构，一些蛋白质的辅基或金属离子往往就结合在其中。例如上述肌红蛋白分子亲水表面上，就有一个疏水洞穴，其中结合着一个含Fe

34、2+的血红素辅基，起着结合并储存氧的功能，供肌肉剧烈收缩氧供应相对不足时释放被利用的需要。如果蛋白质是单条肽链，则三级结构就是它的最高级结构，三级结构由二硫键和次级键（氢键、疏水键、离子键、范德华力）维持。例如肌红蛋白：由153个氨基酸残基形成8个-螺旋段A、B、C、D、E、F、G、H；螺旋段之间的转折为不规则卷曲；在疏水性裂隙中插入1个血红素，F8和E7的两个His残基夹者血红素；F8的His残基连接在血红素中心的Fe原子。蛋白质三级结构的构象特点：（1）三级结构构象近似球形。（2）形成所谓“亲水表面，疏水核”。（3）构象的稳定性主要靠疏水相互作用维系。亲水表面的水化膜和双电层，对分子构象起

35、很好的保护作用。（4）分子表面有一个空穴，是行使生物功能的部位。（5）三级结构形成之后，蛋白质分子的生物活性部位就形成了。（五）蛋白质的四级结构（quaternary structure）蛋白质的四级结构是指各具独立三级结构多肽链再以各自特定形式接触排布后，结集所形成的蛋白质最高层次空间结构。在此蛋白质四级结构中，各具独立三级结构的多肽链称亚基（subunit），亚基单独存在时不具生物活性，只有按特定组成与方式装配形成四级结构时，蛋白质才具有生物活性。注意，由二硫键连接的几条肽链不具有四级结构。每条肽链都有自己的三级结构，称为亚基或亚单位，一般情况下，具有四级结构的蛋白质含有的肽链不会太多，故

36、称这类蛋白质为寡聚蛋白，如寡聚酶等。例如血红蛋白就是由两条相同、各由141个氨基酸残基组成的-亚基和两条相同、各由146个氨基酸残基组成的-亚基按特定方式接触、排布组成的一个球状、接近四面体的分子结构。每个亚基表面疏水洞穴中都分别结合一个含Fe2+血红素辅基。血红蛋白四个亚基间主要靠八个盐键和众多氢键维系其严密、特定的四级结构，完成其在血液中运输氧气的生理功能。具有四级结构的整个蛋白质分子也大多形成一个亲水的分子表面和一个疏水的分子内核。并不是所有蛋白质分子都具有四级结构的。大多数蛋白质都只由一条肽链组成，只具有三级结构就有生理活性了，只有一部分分子量更大、或具有调节功能的蛋白质，才具有四级结

37、构，它由几条肽链组成，从而赋予它特殊的别构作用，这对完成其特定生理功能十分重要。另外由于肽链亚基间的连结键都是非共价键，因此由二硫键相连的，如由四条肽链组成的免疫球蛋白、由A、B二条肽链组成的胰岛素分子，不属于具有四级结构的蛋白质，何况胰岛素还是一个分子量很小的蛋白质。（六）维系蛋白质空间结构的非共价键这些非共价键，包括氢键、盐键、疏水键和范德华力（van der Waals）等。其中维持蛋白质二级结构的主要是氢键，维持蛋白质三级结构的主要是疏水键，维持蛋白质四级结构的有盐键。事实上各层次蛋白质分子空间结构的稳定，都有这些副键共同参与，以保证蛋白质空间结构的相对稳定和各种生理功能的正常发挥。非

38、共价键的键能要比共价键的键能小得多，因此容易断裂，但由于蛋白质分子中非共价键数目众多，因此它们在维持蛋白质严密空间结构和生理功能上起着十分重要的作用。第四节 蛋白质的结构与功能的关系蛋白质的结构与功能的关系<1>每一种蛋白质都具有特定的结构，也具有特定的功能。<2>蛋白质的结构决定了蛋白质的功能。<3>蛋白质的功能直接由其高级结构（构象）决定。例子，蛋白质的变性现象。<4>蛋白质的一级结构决定高级结构（构象），因此，最终决定了蛋白质的功能。一、蛋白质分子一级结构决定其高级结构 安芬森(C.B.Anfinsen)实验：核糖核酸酶的变性与复性实验。这

39、个实验充分证明了蛋白质的功能取决于其特定的天然构象，而规定其构象所需要的信息包含在它的氨基酸序列之中。二、蛋白质一级结构与生物功能（一）一级结构不同,蛋白质功能不同（二）一级结构的关键部分相同，功能相同不同来源的胰岛素都由A、B链，51个aa组成，但一级结构的aa种类并不完全相同。在蛋白质结构和功能关系中，一些非关键部位氨基酸残基的改变或缺失，则不会影响蛋白质的生物活性。例如人、猪、牛、羊等哺乳动物胰岛素分子A链中8、9、10位和B链30位的氨基酸残基各不相同，有种族差异，但这并不影响它们都具有降低生物体血糖浓度的共同生理功能。（三）一级结构改变引起的分子病蛋白质分子中关键活性部位氨基酸残基的

40、改变，会影响其生理功能，甚至造成分子病（molecular disease）。例如镰状细胞贫血，就是由于血红蛋白分子中两个亚基第6位正常的谷氨酸变异成了缬氨酸，从酸性氨基酸换成了中性支链氨基酸，降低了血红蛋白在红细胞中的溶解度，使它在红细胞中随血流至氧分压低的外周毛细血管时，容易凝聚并沉淀析出，从而造成红细胞破裂溶血和运氧功能的低下。所谓“分子病”，首先是蛋白质一级结构的改变，从而引起其功能的异常或丧失所造成的疾病。可见蛋白质关键部位甚至仅一个氨基酸残基的异常，对蛋白质理化性质和生理功能均会有明显的影响。分子病是基因突变引起的遗传性疾病，当然首先就是DNA分子结构的改变，是其分子编码相应蛋白质

41、基因结构的改变，这是1949年美国科学家Pauling在研究血红蛋白时首先提出来的。目前已知血红蛋白分子异常有500多种，其中约一半在临床上可造成分子病。三、蛋白质空间结构与生物功能蛋白质分子空间结构和其性质及生理功能的关系也十分密切。不同的蛋白质，正因为具有不同的空间结构，因此具有不同的理化性质和生理功能。如指甲和毛发中的角蛋白，分子中含有大量的-螺旋二级结构，因此性质稳定坚韧又富有弹性，这是和角蛋白的保护功能分不开的；丝心蛋白正因为分子中富含-片层结构，因此分子伸展，蚕丝柔软却没有多大的延伸性。事实上不同的酶，催化不同的底物起不同的反应，表现出酶的特异性，也是和不同的酶具有各自不相同且独特

42、的空间结构密切有关。（一）空间构象决定蛋白质功能：血红蛋白的构象变化与结合氧 具有四级结构的蛋白质，尚有重要的别构作用（allosteric effect），又称变构作用。别构作用是指一些生理小分子物质，作用于具有四级结构的蛋白质，与其活性中心外别的部位结合，引起蛋白质亚基间一些次级键的改变，使蛋白质分子构象发生轻微变化，包括分子变得疏松或紧密，从而使其生物活性升高或降低的过程。具有四级结构蛋白质的别构作用，其活性得到不断调正，从而使机体适应千变万化的内、外环境，因此推断这是蛋白质进化到具有四级结构的重要生理意义之一。血红蛋白运氧中也有别构作用：当血红蛋白分子第一个亚基与氧结合后，该亚基构象的

43、轻微改变，可导致4个亚基间盐键的断裂，使亚基间的空间排布和四级结构发生轻微改变，血红蛋白分子从较紧密的T型转变成较松弛的R型构象，从而使血红蛋白其他亚基与氧的结合容易化，产生了正协同作用，呈现出与肌红蛋白不同的“S”形氧解离曲线，完成其更有效的运氧功能。氧对生命十分重要，但氧又难溶于水，生物进化到脊椎动物，产生了血红蛋白与肌红蛋白，尤其是血红蛋白具有四级结构和别构作用，使之能更有效地完成运氧功能。它就像撕一张四联邮票，当撕第一张时较费力，但撕第二、三张时就容易些了，当撕到第四张邮票时几乎可以不费力气一样，即血红蛋白变构到第四个亚基与氧的结合时就更容易了。当然，血红蛋白是由四个亚基聚合而成的蛋白

44、质，在变构中亚基是绝对不能分开的，只是整个构象的改变。血红蛋白：Hb（Hemoglobin），在人体中有三种，HbA，HbA 2，HbF（仅存于胎儿中），三者的结构和功能大同小异，此处以HbA为例。一级结构：4条链，22。141，146，每条肽链都结合着一分子的血红素，两条链之间还夹着一分子2，3-DPG（2，3-二磷酸甘油酸），每条肽链都有保守序列。二级结构：4条链均同Mb,几乎全是-右手螺旋，中间由无规卷曲和结来连接。三级结构：4条链均同同Mb, 扁平的菱形，属于球蛋白。四级结构：4个亚基占据着4面体的4个角，链间以离子键结合，一条链与一条链形成二聚体，Hb可以看成是由

45、2个二聚体组成的（）2，在二聚体内结合紧密，在二聚体之间结合疏松。功能：运输氧气。其三级结构在每个肽链的分子表面形成一个疏水的空穴，血红素即藏在其中，该空穴允许O2进入而拒绝水的进入，保证了Fe2+结合O2而避免了Fe2+Fe3+。其氧合曲线为S形曲线，只有在PO2很高的情况下（在肺部）Hb才结合氧气，而PO2一降低（在外周血管中），它就释放O2。Hb的氧合曲线形状与Mb不同是因为它有着Mb所不具有的一些特性，如：协同效应：Hb分子中一条链结合O2后，可以导致其构象的变化，使其它几条链结合O2的结合能力突然增强，表现出其氧合曲线为S形曲线。对Hb协同效应的解释为：在没有结合氧气时，Hb的四条链

46、之间结合紧密，这种构象称为T态，这种紧密是由离子键和DPG（位于2条链之间）造成的，屏蔽了分子表面疏水的空穴，使Hb分子结合O2的能力降低（游离的链和链结合氧气的能力与Mb相同）。当一条链结合了氧气之后，铁卟啉把His的咪唑基向下一扯，导致该肽链的三级结构发生变化（牵一发而动全局），肽链之间的离子键被破坏，Hb的四级结构也随之改变，2个二聚体（）之间发生错位，挤出DPG，四级结构进一步变化，每条链表面疏水的空穴暴露在外，这种构象称为R态，结合氧气的能力得以增强。别构效应：是某些寡聚蛋白质特有的现象。是指蛋白质与效应物结合改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性。Hb的活性中心：Hb每个亚基上

47、血红素存在的那个疏水空穴是结合氧气的地方，称之为活性中心，也叫活性部位。别构中心：在Hb分子的其它地方还有结合效应物的部位，如结合H+、CO2、DPG甚至O2，这些部位结合了效应物之后，可以改变蛋白质的构象，进而影响到活性中心与氧气的结合，这些部位就叫别构中心。活性中心与别构中心可以重合也可以不重合，在Hb中是不重合的。因此，别构效应可以说成是别构中心结合了效应物之后影响了活性中心与氧气的结合。协同效应实际上就是一种别构效应。Mb只有活性中心没有别构中心，它的氧合曲线就是双曲线形的。Hb的另一个别构效应是波尔效应：H+、CO2对Hb与氧气结合的影响。H+、CO2促进Hb释放O2，这也解释了Hb

48、为什么在肺中吸氧排CO2,而在肌肉中吸CO2排氧。另外，DPG降低Hb与O2的结合能力。关于镰刀形细胞贫血症：红细胞减少，只有正常人的1/2，无力，剧烈运动会导致死亡。Hbs与HbA在结合O2的能力方面并没有区别，区别在于Hbs造成红细胞溶血，溶血后的Hb不能像红细胞中的Hb一样正常运输O2。Hbs导致溶血的原因在于其6Val，正常的血红蛋白的6Glu，红细胞表面的Hbs由于疏水键而聚集，使细胞膜破裂。 第五节 蛋白质的理化性质一、蛋白质分子的大小蛋白质的分子量：一般在一万至一百万道尔顿之间（1100万）。测定蛋白质相对分子质量的方法：（一）根据化学组成测定最低相对分子质量已知蛋白质中某一微量

49、元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，计算蛋白质的最低分子量。例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%，计算二者的相对分子质量。最低相对分子量（铁的原子量/铁的百分含量）x 100=（55.8/0.335）x 100=16700 也可用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。（二）沉降分析法测定相对分子质量沉降系数：特定蛋白质，沉降速度与离心加速度的比是常数，称为沉降系数，单位S。一个S单位是l×10-13秒，分子量越大，沉降系数越大，但不成正比。蛋白质的沉降系数大都在1200S之间。（三）凝胶过滤法测定相对分子质量（四）SDS聚丙烯酰胺凝胶电

50、泳法测定相对分子质量二、蛋白质的胶体性质大分子，多于51个aa残基，最小平均分子量为5000D；在水中能两性解离故而带电，又亲水，所以是胶体，分散好。有电泳、布朗运动、丁达尔现象、不能通过半透膜等等典型的胶体性质。蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体。因为:水膜（水化层）；相同电荷。三、蛋白质的两性解离和等电点当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。等电点沉淀法：PI处蛋白质的溶解度最低。四、蛋白质的变性与复性变性是指在一些物理或化学因素作用下，使蛋白质分子空间结构破坏，从而引起蛋白质理化性质改变，包括结晶性能

51、消失。蛋白质溶液粘度增加，呈色反应加强及易被消化水解等，尤其是溶解度降低和生物活性丧失的过程。蛋白质变性的机理是分子中非共价键断裂，使蛋白质分子从严密且有序的空间结构转变成杂乱松散、无序的空间结构，因此生物活性也必然丧失；同时由于蛋白质变性后，分子内部的疏水基团暴露到了分子的表面，因此其溶解度降低、容易沉淀析出。变性的蛋白质大多沉淀，但沉淀的蛋白质在蛋白质分离纯化中并不是变性的。造成蛋白质变性的物理、化学条件有加热、紫外线、X射线和有机溶剂，如乙醇、尿素、胍和强酸、强碱、重金属盐等。蛋白质变性虽是能逆转的，因为此时蛋白质的一级结构并未遭到破坏，故若变性时间短、变性程度较轻，理论上在合适的条件下，变性蛋白质分子尚可重新卷曲形成天然空间结构，并恢复其生物活性，这即称为蛋白质的复性（renaturation），但目前情况