分子生物学-第五讲DNA的损伤修复与DNA转座ppt课件

1、第五讲第五讲 DNA损伤、修复损伤、修复和和DNA转座转座第一节第一节 损伤要素及其类型损伤要素及其类型第二节第二节 复制过程中的错配修复复制过程中的错配修复第三节第三节 损伤修复损伤修复第四节第四节 细菌中的转座成分细菌中的转座成分 第五节第五节 真核生物中的转座成分真核生物中的转座成分第一节第一节 损伤要素及其类型损伤要素及其类型引起损伤的要素引起损伤的要素: 自发性损伤自发性损伤(复制中的损伤、碱基的自发性化学改动、复制中的损伤、碱基的自发性化学改动、 自发脱碱基、自发脱碱基、 细胞的代谢产物对细胞的代谢产物对DNA的损伤的损伤) 物理要素引起的损伤物理要素引起的损伤(电离辐射、紫外线电

2、离辐射、紫外线) 化学要素引起的损伤烷化剂、碱基类似物化学要素引起的损伤烷化剂、碱基类似物 引起损伤的类型：引起损伤的类型： 碱基零落、碱基或核苷改动、错误碱基碱基的取碱基零落、碱基或核苷改动、错误碱基碱基的取 代、碱基的插入或缺失、链的断裂、链交联链内、链代、碱基的插入或缺失、链的断裂、链交联链内、链 间、嘧啶二聚体等等间、嘧啶二聚体等等 广义的修复系统：广义的修复系统： DNA聚合酶的校正功能聚合酶的校正功能(复制的范畴复制的范畴) 错配修复系统错配修复系统 损伤修复系统损伤修复系统(光复活、重组修复、光复活、重组修复、SOS修复等修复等) 第二节第二节 复制过程中的错配复制过程中的错配的

3、修复的修复 DNA mismatch+ - A- -C-DNApol (= 10-8)经第二次校正经第二次校正= 10-11错配修复错配修复系统系统(MRSMismatch RepairSystem)1、错配修复碱基来源：校正活性所漏校的碱基、错配修复碱基来源：校正活性所漏校的碱基 使复制的保真性提高使复制的保真性提高102103倍倍2、错配修复系统、错配修复系统Mismatch repair systemDNA polymeraseHelicase SSB 外切核酸酶外切核酸酶 (和和) 衔接酶衔接酶MCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mutH,

4、 L, S dam geneDNA腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶甲基化酶)扫描新生链中错配碱基扫描新生链中错配碱基识别新生链中非识别新生链中非 m6A 的的GATC序列序列酶切含错配碱基的新生酶切含错配碱基的新生DNA区段区段 1组成组成 DNA DNA合成过程中的甲基化变化合成过程中的甲基化变化DNA中的中的GATC(palindromic seq.)为为m6A甲基化敏感位点甲基化敏感位点平均每平均每2kb左右有一左右有一GATC seq.错配修复系统受甲基化的引导错配修复系统受甲基化的引导 甲基化程度的差别甲基化程度的差别a、MutH/MutS 扫描识别错配扫描识别错配 碱基

5、和临近的碱基和临近的GATC序列序列 切点甲基化切点甲基化GATC中中 G的的5侧侧 DNA helicase II, SSB, exonuclease I去除包括错去除包括错 配碱基的片段配碱基的片段 DNA polymerase III 和和 DNA ligase 填充缺口填充缺口昂贵的代价用于保证昂贵的代价用于保证DNADNA的准确性的准确性2 2 修复过程修复过程 外切核酸酶外切核酸酶切割切点的切割切点的55端错配碱基在切点的端错配碱基在切点的55端端 -3 -3端端-3-3端端3、 尿嘧啶尿嘧啶-N-糖苷酶系统糖苷酶系统 ( ung system )修复尿嘧啶的来源：修复尿嘧啶的来源

6、：dUTP的渗入的渗入 胞嘧啶的自发脱氨氧化胞嘧啶的自发脱氨氧化-TAGC-ATCG-TAGC-A CG-U-TAGC-ung-ase GCUAU-TAGC-A CG-AP内切酶内切酶(Apurinase)-TAGC-ATCG-DNApolLigase 第三节第三节 DNA损伤的修复损伤的修复一、嘧啶二聚体的产生一、嘧啶二聚体的产生 类型：类型：TT二聚体二聚体 、CC二聚体二聚体 、 CT二聚体二聚体 TTCCCT相邻的胸腺嘧啶相邻的胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体CCCCCCCC PR1、光复活、光复活photo reactivation -TT-AA-TT-AA-TT-AA-TT-A

7、A- 复制前、不容易出错复制前、不容易出错 400 nm 蓝光、蓝光、PR 酶酶 (photo-reactivation enzyme) 光敏裂合酶光敏裂合酶photolyase可见光激活可见光激活 二、二聚体修复的机制二、二聚体修复的机制2. 2. 切除修复切除修复ExisionRepair ExisionRepair 复制前进展复制前进展 不易出错不易出错UvrA, B, C gene 内切核酸酶内切核酸酶Endonucleases 外切核酸酶外切核酸酶 Exonuclease DNA pol Ligase 碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复碱基切除修复碱基切除修复核苷酸

8、切除修复核苷酸切除修复ABA BCA B CA BCAB螺旋酶螺旋酶Pol 螺旋酶螺旋酶衔接酶衔接酶切切补补切切封封3. 3. 重组修复重组修复RecombinativeRepairRecombinativeRepair后复制修复、后复制修复、E.coli的挽回系统的挽回系统E.coli 存活存活%U.V 计量计量w.t. UvrA+ RecA+ uvr a-rec a-该系统存在的实验证据该系统存在的实验证据 Rec-A. gene 以某种方式参与DNA损伤修复 Rec修复系统比切除修复系统更有效修复系统比切除修复系统更有效 目前知道目前知道 Uvr系统担任切除二聚体系统担任切除二聚体 Re

9、c系统担任消除没有被切除的二聚体系统担任消除没有被切除的二聚体 能够呵斥的后果能够呵斥的后果TT TTAA AATT TTTT TTAA AATT TT变性变性 E.coli (Rec-A, uvr-a-)D.S. DNAS.S. DNAU.V. 复制复制提取提取 变性变性复制过程越过二聚体而在相应新链上留下缺口复制过程越过二聚体而在相应新链上留下缺口二聚体后起始二聚体后起始 修复时期的证明 与与Rec-A蛋白引起的重组蛋白引起的重组(strand transfer)有关有关 TT dimer未被修复，仅表如今后代群体中未被修复，仅表如今后代群体中TT dimer 浓度的稀释浓度的稀释 链的非

10、准确转移，导致突变机率的添加链的非准确转移，导致突变机率的添加 修复相关机制修复相关机制: 重组修复重组修复 ( (链转移修复链转移修复) ) 复制后修复复制后修复 容易出错容易出错 RecA, DNApolymerae ligase二聚体后起始二聚体后起始 RecA 聚合酶、衔接酶聚合酶、衔接酶重组修复后的损伤位点可重组修复后的损伤位点可由其它机制进一步修复由其它机制进一步修复4. 4. 易错修复易错修复SOSSOS修复修复 SOS repair SOS repairE.coliE.coliE.coli 80 10 80 10 100100mut. 100% 50% mut. 100% 50

11、% 10%10% 损坏的噬菌体损坏的噬菌体 DNA 在在E.coli A被修复被修复 E. coli 的的SOS修复能被修复能被U.V.诱导诱导 (A & B) SOS 修复过程有非常高的突变频率修复过程有非常高的突变频率(易出错易出错)ABCUV 复活或复活或 W复活复活Jean Weigh1 1 实验证据实验证据2 SOS 修复机制修复机制 SOS 修复无模板指点的修复无模板指点的DNA复制复制 大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生 SOS系统诱导，错误埋伏的复系统诱导，错误埋伏的复制超越二聚体而进展酶无校制超越二聚体而进展酶无校正功能正功能错误

12、碱基错误碱基 SOS 修复只是修复只是SOS反响的一部分反响的一部分 RecA在在SOS反响反响反响中起中心作用反响中起中心作用 RecA与与LexA组成组成调控环路调控环路DNA 损伤损伤 SOS RecA RecA受受LexALexA的的部分抑制部分抑制RecA-P： 三种功能三种功能a、 DNA 重组活性重组活性b、 与与S.S. DNA结合活性结合活性c、 少数蛋白的少数蛋白的proteinase活性活性当当DNA正常复制时正常复制时无复制受阻，无无复制受阻，无DNA损伤，损伤， 无无TT dimer RecA-p不表现不表现proteinase活性活性第三节第三节 细菌中的转座成分细

13、菌中的转座成分一、转座成分概述一、转座成分概述1、转座子、转座子(元元)或转座元件或转座元件(transposon or transposable element): 基因组上不用借助于宿主基因就可以自主复制和挪动的基因组上不用借助于宿主基因就可以自主复制和挪动的DNA片段，片段，它们可以直接从基因组的一个位点移到另一个位点供体和受体它们可以直接从基因组的一个位点移到另一个位点供体和受体转座转座transposition：转座元的转移过程不非常确切：转座元的转移过程不非常确切2、发现和开展、发现和开展 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、

14、糊粉层花斑突变玉米果皮、糊粉层花斑突变1983. Barbara McClintock (86y)DNA transposable element 1947 冷泉港实验室美冷泉港实验室美 Barbara McClintock 玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理腾跃基玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理腾跃基因因jumping gene 基因转座景象的再次发现与证明基因转座景象的再次发现与证明 二、二、Prok.转座子种类转座子种类 两种类型：两种类型： 简单转座子简单转座子simple transposon 插入序列插入序列 insertion sequence IS 复合转座子复合转座子compo

15、site transposon 共同特征：共同特征： a两端有两端有2040bp的的IR b具有编码转座酶具有编码转座酶transposase的基因的基因1、插入序列、插入序列 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分 命名：命名： IS编号鉴定类型编号鉴定类型 长度长度 7002000bp 特点：特点： a两端两端IR为转座酶的识别位点突变为转座酶的识别位点突变 b插入靶位点后会出现靶位点的正向反复插入靶位点后会出现靶位点的正向反复39bp IS 可以正反方向插入到可以正反方向插入到DNA宿主、质粒或某些噬菌体，宿主、质粒或某些噬菌体，

16、 常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应a) Tn / TnA family a) Tn / TnA family l 具有具有IR、转座酶基因、转座酶基因、 调理基因解离酶、抗抗生素基因调理基因解离酶、抗抗生素基因 l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) 2.5 kb 20 kb Tn3 IR TnpA Res TnpR AmpR IR 38bp 38bp 转座酶转

17、座酶 regulator - regulator - 内酰胺酶内酰胺酶 2、复合转座子、复合转座子 两种类型两种类型 b两端反复序列为两端反复序列为IS的复合转座子的复合转座子 e.g. IS插入到功能基因两端，能够构成复合转座因子插入到功能基因两端，能够构成复合转座因子IS ISIS IS L IS R臂臂 中心区中心区 臂臂transposition 当两个当两个IS组件一组件一样时，其中任一个都样时，其中任一个都可行使转座功能可行使转座功能 不同时，主要依不同时，主要依托一个托一个 两侧的两侧的IS既可以是既可以是IR，又可以是，又可以是DR形状形状IR多多3 转座噬菌体转座噬菌体 Mu

18、 phage 巨型转座子巨型转座子 C repressor for A, BB 33 kd 与转座有关与转座有关A 70 kd 转座酶转座酶U, S 毒性蛋白毒性蛋白attL, attR 与寄主同源，反向反复，转座必需与寄主同源，反向反复，转座必需 Gin G区倒位酶区倒位酶 att L C A B S U att R 150bp 1.5kb G 倒位区倒位区 38kbPgin 以以E.coli为寄主的温暖型噬菌体溶源、裂解为寄主的温暖型噬菌体溶源、裂解 Mu的插入途径的插入途径a 侵入的侵入的Mu在溶源化过程中恣意插入寄主在溶源化过程中恣意插入寄主DNA 两侧各两侧各5bp的靶位点序列反复的

19、靶位点序列反复b 进入裂解生长后，复制产生后代进入裂解生长后，复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主几乎全部插入寄主 DNA中，并可继续转座构成寄主中，并可继续转座构成寄主DNA和和Mu的共合体，噬的共合体，噬 菌体成熟时，切段共合体包装菌体成熟时，切段共合体包装三、转座子的转作机制及方式三、转座子的转作机制及方式 三种类型：复制型、非复制型和保守型三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座方式、复制型转座方式 本质：转座子元件被复制并被挪动到受体位点，最终转座过程本质：转座子元件被复制并被挪动到受体位点，最终转座过程 扩增了转座子的拷贝供、受点扩增了转座子的拷贝供、受点 需两种酶：需

20、两种酶： 转作酶作用于原拷贝两末端转作酶作用于原拷贝两末端 解离酶作用于复制后的拷贝解离酶作用于复制后的拷贝 方式：方式： 两大步两大步 a) 共合体构成共合体构成 切口衔接复制切口衔接复制 b) 拆分拆分 靶位点的靶位点的DR构成构成2、非复制型转座方式、非复制型转座方式 供体上最终产生双链断裂供体上最终产生双链断裂 供体位点如不能被修复那么供体位点如不能被修复那么有致有致 死效应死效应3、保守型转座方式、保守型转座方式 另一种非复制型另一种非复制型 与与整合机制类似整合机制类似 其转座酶与其转座酶与整合酶家整合酶家 族有关族有关四、转座子转座频率的调控四、转座子转座频率的调控 每个转座子控制本身转座的中心每个转座子控制本身转座的中心-控制转座酶的程度控制转座酶的程度 不到一个转座酶分子世代细胞不到一个转座酶分子世代细胞Tn10转座机制转座机制 Tn10为复合型转座子为复合型转座子 IS10R元件提供转座酶活性元件提供转座酶活性-合成转座酶的序列合成转座酶的序列 自发转座频率自发转座频率-107 Tn10转座酶程度是控制转座的关键转座酶程度是控制转座的关键第四节第四节 真核生物的转座成分真核生物的转座成分 真