高级生化第4章,糖蛋白的概述及蛋白聚糖

1、第四章 糖蛋白与蛋白聚糖4.1. 概述概述 糖类指多羟基醛和多羟基酮及其缩合产物，糖类指多羟基醛和多羟基酮及其缩合产物， carbohydratecarbohydrate曾译为碳水化合物；曾译为碳水化合物；saccharidesaccharide更多地更多地与 前 缀 组 词 ， 如与 前 缀 组 词 ， 如 m o n o s a c c h r i d em o n o s a c c h r i d e ( ( 单 糖单 糖 ) ) 、oligosaccharide(oligosaccharide(寡糖寡糖) )和和polysaccharide(polysaccharide(多糖多糖)

2、)等；等；sugarsugar除表示食糖外还用于表述糖类的组成，常有单除表示食糖外还用于表述糖类的组成，常有单糖的含义；糖的含义；glycanglycan则译为聚糖，是寡糖和多糖的统则译为聚糖，是寡糖和多糖的统称。，糖类仅仅被视为主要的能源物质、碳源和结构称。，糖类仅仅被视为主要的能源物质、碳源和结构材料，对糖类的研究局限于单糖及其代谢，以及淀粉、材料，对糖类的研究局限于单糖及其代谢，以及淀粉、糖原等少数多糖。虽然早就发现糖糖原等少数多糖。虽然早就发现糖- -肽共价复合物，肽共价复合物，鉴于一些含糖的酶类去掉糖组分之后活性并无明显改鉴于一些含糖的酶类去掉糖组分之后活性并无明显改变，因而把糖组分

3、当作杂质，千方百计加以去除。变，因而把糖组分当作杂质，千方百计加以去除。(1)(1)复合糖的分类：复合糖的分类： 复合糖复合糖(complex carbohydrate)可分为可分为 聚糖聚糖(glycam)和糖缀合物或糖复合物和糖缀合物或糖复合物(glycoconjugate)。其。其中 聚 糖 包 括 同 聚 糖中 聚 糖 包 括 同 聚 糖 ( h o m o g l y c a n ) 和 杂 聚 糖和 杂 聚 糖(heteoglycan)；糖缀 合 物 则 包 括 糖 肽 复 合 物；糖缀 合 物 则 包 括 糖 肽 复 合 物(glycopeptede complex)、糖脂复合物

4、、糖脂复合物(glycolipid complex)和糖和糖-核酸复合物核酸复合物(carbohydrate-nucleic acid complex)。糖肽复合物可分为肽聚糖。糖肽复合物可分为肽聚糖(peptideglycan)或或胞壁质胞壁质(murein)，是细菌细胞壁结构材料；糖蛋白，是细菌细胞壁结构材料；糖蛋白(glycoprotein)和蛋白聚糖和蛋白聚糖(proteoglycan)。糖脂可分为。糖脂可分为糖鞘脂糖鞘脂(glycosphingolipid)、 糖 基 酰 基 甘 油、 糖 基 酰 基 甘 油(glycosylacylglyceride)和脂多糖和脂多糖(lipopo

5、lysaccharide)。(2)(2)糖蛋白和蛋白聚糖中常见的单糖组分糖蛋白和蛋白聚糖中常见的单糖组分： 糖复合物中常见的单糖组分包括糖复合物中常见的单糖组分包括4种己糖：种己糖：D-葡萄葡萄糖糖(D-Glc)、D-半乳糖半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖甘露糖(D-Man)、L-岩藻糖岩藻糖(L-Fuc)；两种乙酰化己糖胺：；两种乙酰化己糖胺：N-乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺乙酰半乳糖胺(GalNAc)；两种糖醛酸：；两种糖醛酸：D-葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸(GlcA)和和L-艾杜糖醛酸艾杜糖醛酸(IdoA)；一种戊糖：；一种戊糖：D-木糖木糖(D-Xyl)以及甘露

6、糖胺与磷酸烯醇式丙酮酸缩合以及甘露糖胺与磷酸烯醇式丙酮酸缩合产物，它的产物，它的4、7、9-位羟基和位羟基和5-氨基发生取代产生一系氨基发生取代产生一系列产物，统称唾液酸列产物，统称唾液酸(Sia)，其中最重要的是，其中最重要的是N-乙酰乙酰-D-神经氨酸神经氨酸(NeuNAc)等。等。(3) 3) 聚糖结构的复杂性：聚糖结构的复杂性： 糖蛋白和蛋白聚糖的聚糖部分尽管由上述为数有限的糖蛋白和蛋白聚糖的聚糖部分尽管由上述为数有限的几种单糖组成，但每种单糖有吡喃式与呋喃式结构之分，几种单糖组成，但每种单糖有吡喃式与呋喃式结构之分，异头碳有异头碳有- -与与- -型之分，每个单糖有多个羟基，可能以型

7、之分，每个单糖有多个羟基，可能以不同的方式形成糖苷键和分枝结构。两种不同的氨基酸可不同的方式形成糖苷键和分枝结构。两种不同的氨基酸可形成两种二肽；形成两种二肽；3 3种不同的氨基酸可形成种不同的氨基酸可形成6 6种三肽；种三肽；6 6种不种不同的氨基酸可产生同的氨基酸可产生176176种六肽。而两种相同的己糖可能形种六肽。而两种相同的己糖可能形成成1111种二糖；三种相同的己糖可产生种二糖；三种相同的己糖可产生176176种三糖；种三糖；6 6种不同种不同的己糖则能形成的己糖则能形成10109 9种六糖，如带有分枝六糖的数目可达种六糖，如带有分枝六糖的数目可达10101212个。如果考虑到糖残

8、基不同部位进一步修饰：磷酸化、个。如果考虑到糖残基不同部位进一步修饰：磷酸化、硫酸化、氨基化、乙酰化、糖基内部脱水成内醚等，聚糖硫酸化、氨基化、乙酰化、糖基内部脱水成内醚等，聚糖的的 数目无疑会更大。聚糖结构的复杂性增加了研究工作数目无疑会更大。聚糖结构的复杂性增加了研究工作的难度，同时暗示它可以蕴含更多的信息，成为生物信息的难度，同时暗示它可以蕴含更多的信息，成为生物信息的理想载体。的理想载体。(4) (4) 糖缀合物的许多重要的性质和糖缀合物的许多重要的性质和功能与其糖链特有的结构密切相关功能与其糖链特有的结构密切相关，为了便于表现糖链的结构，我们将采用一为了便于表现糖链的结构，我们将采用

9、一套流行的简化符号系统套流行的简化符号系统( (图图4.1)4.1)，标明糖，标明糖链单糖之间的连接方式及其修饰状况。链单糖之间的连接方式及其修饰状况。图4.1 推荐的描述糖链结构的简化符号与惯例以一个复杂型以一个复杂型分枝的双天线分枝的双天线N-聚糖为例。聚糖为例。除除L-Fuc和和L-IdoA外，其余外，其余糖基均为糖基均为D-型；型；糖链中的单糖糖链中的单糖都是吡喃型都是吡喃型(六六元环元环)的；除的；除Sia的糖苷链从的糖苷链从C2开始，其余开始，其余糖基的糖苷链糖基的糖苷链均从均从C1开始开始。4.2. 糖蛋白糖蛋白(glycoprotein) 广义的糖蛋白泛指糖肽共价复合物。为了研

10、广义的糖蛋白泛指糖肽共价复合物。为了研究的方便，目前已将肽聚糖和蛋白聚糖划分出来，究的方便，目前已将肽聚糖和蛋白聚糖划分出来，狭义的糖蛋白专指肽链与一个或多个聚糖链共价狭义的糖蛋白专指肽链与一个或多个聚糖链共价结合形成的复合物，其聚糖链通常少于结合形成的复合物，其聚糖链通常少于1515个单糖个单糖残基（少数聚糖链可能含有残基（少数聚糖链可能含有2002003030个单糖残个单糖残基），且大多数具有分枝。基），且大多数具有分枝。4.2.1 4.2.1 糖蛋白的结构糖蛋白的结构4.2.1.1 4.2.1.1 糖蛋白结构研究糖蛋白结构研究 糖蛋白的结构研究包括蛋白质部分的结构糖蛋白的结构研究包括蛋白

11、质部分的结构测定和糖链部分的结构测定。测定和糖链部分的结构测定。糖蛋白糖蛋白糖链数目糖链数目糖链平均间距糖链平均间距血清糖蛋白血清糖蛋白511-酸性糖蛋白酸性糖蛋白460胎球蛋白胎球蛋白6113人触珠蛋白人触珠蛋白13209人人2-巨球蛋白巨球蛋白31296牛甲状腺球蛋白牛甲状腺球蛋白19375人转铁蛋白人转铁蛋白2776人人IgG2胰糖蛋白：胰糖蛋白：124牛胰牛胰RNaseB1270DNase1粘蛋白：粘蛋白：羊领下腺粘蛋白羊领下腺粘蛋白8006猪领下腺粘蛋白猪领下腺粘蛋白5008胶原：胶原：兔角膜胶原兔角膜胶原19173牛皮肤胶原牛皮肤胶原8435大鼠皮肤胶原大鼠皮肤胶原4770兔巩膜胶

12、原兔巩膜胶原31000表4-1 糖蛋白中糖链数目与间距的变动 (1)(1)聚糖链与蛋白质的分离：聚糖链与蛋白质的分离： 从糖蛋白释放完整的从糖蛋白释放完整的N-N-聚糖可采用专一的肽：聚糖可采用专一的肽：N-N-糖苷酶糖苷酶F F水解，也可用肼解裂解。水解，也可用肼解裂解。O-O-聚糖可用内切聚糖可用内切 - N - N - 乙 酰 氨 基 半 乳 糖 苷 酶 水 解 ， 或 在乙 酰 氨 基 半 乳 糖 苷 酶 水 解 ， 或 在 0 . 0 50 . 0 5 0.1mol0.1mol L L1 1 NaOH NaOH_ _ mol molL L1 1 NaBH NaBH4 4通过通过- -

13、消去反应消去反应来完成。反应中产生的聚糖还原端被来完成。反应中产生的聚糖还原端被NaBHNaBH4 4还原成对碱还原成对碱稳定的糖醇，以防糖链被碱降解。如用稳定的糖醇，以防糖链被碱降解。如用3 3H H标记的硼氢标记的硼氢化钠，可对释放的聚糖还原端进行标记，便于在分离化钠，可对释放的聚糖还原端进行标记，便于在分离纯化中跟踪。也可用蛋白酶降解。产物进行分级分离纯化中跟踪。也可用蛋白酶降解。产物进行分级分离与纯化，得到不同的糖肽和或聚糖链，即可用于结与纯化，得到不同的糖肽和或聚糖链，即可用于结构分析。构分析。1(2) (2) 聚糖的单糖组分分析：聚糖的单糖组分分析： 用糖苷酶或酸碱将上述糖肽水解，

14、把其中的单用糖苷酶或酸碱将上述糖肽水解，把其中的单糖组分转变成热稳定挥发性衍生物糖组分转变成热稳定挥发性衍生物( (如糖三甲基硅醚、糖如糖三甲基硅醚、糖醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等) )，再用气，再用气- -液相色谱法液相色谱法(gas-(gas-liquid chromatography,GLC)liquid chromatography,GLC)进行鉴定和定量，检测精进行鉴定和定量，检测精度可达度可达n moln mol级。级。GLCGLC与质谱法与质谱法(mass spectrometry,MS)(mass spectrometry,MS)联用，检测精度可达联用，检测

15、精度可达10pmol10pmol级。如将单糖还原端进行荧光级。如将单糖还原端进行荧光标 记 ， 再 用标 记 ， 再 用 H P L C ( h i g h - p r e s s u r e l i q u i d H P L C ( h i g h - p r e s s u r e l i q u i d chromatoqraphychromatoqraphy) )与荧光测仪对其进行鉴定和定量，检测与荧光测仪对其进行鉴定和定量，检测精度可达精度可达pmolpmolfmolfmol水平。水平。19801980年代年代HPAEC-PAC(high pH HPAEC-PAC(high pH

16、anion-exchange chromatography with pulsed anion-exchange chromatography with pulsed amperometricamperometric detection) detection)用于单糖组分分析，无需制备用于单糖组分分析，无需制备单糖衍生物，检测精度可达单糖衍生物，检测精度可达5 550 pmol50 pmol水平。氨基糖可用水平。氨基糖可用氨基酸分析仪测定；唾液酸除用灵敏度较低的比色法测定氨基酸分析仪测定；唾液酸除用灵敏度较低的比色法测定外，已能利用高灵敏度外，已能利用高灵敏度GLC-MSGLC-MS对离子化的

17、唾液酸进行测定。对离子化的唾液酸进行测定。(3) 糖链结构分析糖链结构分析： 已发展了一系列技术，可对糖链中每个单糖残基的异头结构已发展了一系列技术，可对糖链中每个单糖残基的异头结构(或或)、环式结构类型、环式结构类型(p(p或或f)f)以及与其它糖残基连接键的位置进以及与其它糖残基连接键的位置进行测定。这些方法包括外切糖苷酶消化，利用特异性极高的外切糖行测定。这些方法包括外切糖苷酶消化，利用特异性极高的外切糖苷酶水解糖链，再用苷酶水解糖链，再用HPLCHPLC、HPTLC (high- performance thin-HPTLC (high- performance thin-layer

18、chromatography)layer chromatography)和和HPCE(high-performance capillary HPCE(high-performance capillary electrophoresis)electrophoresis)成套仪器进行检测，精度达成套仪器进行检测，精度达fmolfmolpmolpmol级，可得级，可得到糖基连接链位置的信息。由于可用的高专一性外切糖苷酶种类有到糖基连接链位置的信息。由于可用的高专一性外切糖苷酶种类有限，这种方法的应用有很大的局限性。甲基化分析法利用甲基化等限，这种方法的应用有很大的局限性。甲基化分析法利用甲基化等修饰

19、反应制备糖衍生物，经修饰反应制备糖衍生物，经GLCGLC与质谱仪联用进行检测，精度可达与质谱仪联用进行检测，精度可达0.10.110 pmol10 pmol，可鉴定和定量残基上特定位点取代以及糖的环式构，可鉴定和定量残基上特定位点取代以及糖的环式构型。质谱法在糖结构分析中可测定糖环上键的类型与位置，如采用型。质谱法在糖结构分析中可测定糖环上键的类型与位置，如采用FAB(fast-atom bombardment)FAB(fast-atom bombardment)、LSIMS(liquid secondary ion LSIMS(liquid secondary ion mass spectr

20、ometry)mass spectrometry)和和MSMSMS(tandem mass spectrometry)MS(tandem mass spectrometry)，检测，检测精度可达精度可达fmolfmolpmolpmol水平。水平。NMR(nuclear maqneticNMR(nuclear maqnetic resonance) resonance)用用于糖结构分析可测定糖基的异头构型和键的位置，精度达于糖结构分析可测定糖基的异头构型和键的位置，精度达10pmol10pmoln moln mol水平，最显著的优点是无需制备糖衍生物水平，最显著的优点是无需制备糖衍生物。 (4)

21、 糖链序列分析糖链序列分析： 早期曾用外切糖苷酶从糖链非还原端依次切下早期曾用外切糖苷酶从糖链非还原端依次切下特定的单糖，同样由于可用的酶种类有限，而且进特定的单糖，同样由于可用的酶种类有限，而且进行糖链序列分析的糖苷酶纯度应当极高，因而限制行糖链序列分析的糖苷酶纯度应当极高，因而限制了这种方法的应用，常用的糖苷酶见表了这种方法的应用，常用的糖苷酶见表4.24.2。19801980年年代之前，糖链测序主要用代之前，糖链测序主要用MSMS和和MS-GLCMS-GLC法，需对样品法，需对样品进行甲基化、乙酰化等预处理。进行甲基化、乙酰化等预处理。19801980年后采用年后采用FAB-FAB-MS

22、MS和和ESI(electrosprayESI(electrospray ionization)-MS ionization)-MS，检测精度，检测精度达达n moln molp molp mol水平。水平。酶酶来来 源源专专 一一 性性Clostridium perfringensFuc1 2Gal-L-岩藻糖苷酶岩藻糖苷酶Diplococcu.s pneumoniasGal1 4GlcNAc-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Canavalia ensiformisMan1 2/6Man-甘露糖苷酶甘露糖苷酶Diplococcus pneumoniasGlcNAc1 glycan-D-N乙酰氨基葡萄糖苷

23、酶乙酰氨基葡萄糖苷酶Diplococcus pneumoniasSia2 3/6Gal神经氨酸酶神经氨酸酶Sia2 6GkNAc内切糖苷酶内切糖苷酶内切内切-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Bacteroides fragillis-GlcNAc1-3Gal1 3/4GalNAc-Flavobacteriummeningoseptiumx-ManMan-GlcNAc-GlcNAc1Asn-x-ManD-糖苷酶糖苷酶Diplococcus pneumoniasGal1-3GalNAc1 Ser/Thr外切糖苷酶外切糖苷酶N-糖苷酶糖苷酶F表4.2 用于聚糖测序的几种糖苷酶4.2.1.2 糖-肽连接键的类

24、型 糖蛋白中的聚糖链均由其还原端以接枝方式与肽链特定部糖蛋白中的聚糖链均由其还原端以接枝方式与肽链特定部位的氨基酸侧链基团相连接，主要分为以下两大类：位的氨基酸侧链基团相连接，主要分为以下两大类：(1) N-(1) N-连接键：连接键： D-GlcNAcD-GlcNAc-Asn-Asn，又称，又称型糖肽键，由糖链还原端的型糖肽键，由糖链还原端的-D-GlcNAc-D-GlcNAc残基残基C1-OHC1-OH基与多肽链基与多肽链AsnAsn残基侧链酰胺残基侧链酰胺-NH-NH2 2间缩合，间缩合，形成形成C-NC-N糖苷键，广泛分布于许多糖蛋白中。以肽链糖苷键，广泛分布于许多糖蛋白中。以肽链N

25、N端端-NH-NH2 2为为连接点形成的连接点形成的N-N-糖糖- -肽键迄今仅见于血红蛋白肽键迄今仅见于血红蛋白AlcAlc。(2) O-(2) O-连接键：连接键： 由糖链还原端与含羟基的氨基酸侧链由糖链还原端与含羟基的氨基酸侧链-OH-OH间形成间形成C-OC-O糖苷键。糖苷键。又可分为：又可分为：D-GalNAc-Ser/ThrD-GalNAc-Ser/Thr，又称为，又称为(i)(i)型糖型糖- -肽键，肽键，分布广泛。分布广泛。D-Xyl-Ser/ThrD-Xyl-Ser/Thr，又称，又称(ii)(ii)型糖型糖- -肽键，主要肽键，主要存在于一些蛋白聚糖中。存在于一些蛋白聚糖中

26、。D-Gal-HylD-Gal-Hyl，又称，又称型糖型糖- -肽键，肽键，主要存在于胶原和丝心蛋白中。主要存在于胶原和丝心蛋白中。D-Ara-HypD-Ara-Hyp，仅见于高等植，仅见于高等植物中的一些糖蛋白。物中的一些糖蛋白。 型乳糖 Gal（14）Glc蔗 糖Fru（21）Glc茧 蜜 糖Glc（11）Glc区区 别别N-聚糖聚糖O-GalNAc聚糖聚糖糖糖-肽键肽键GlcNAc1-N（Asn-x-Ser/Thr）GalNAc1-O（Ser/Thr）聚糖组成聚糖组成都含都含Man，GlcNAc,绝大多数不含绝大多数不含GalNAc都含都含GalNAc,不含不含Man糖链分枝糖链分枝全部

27、分枝全部分枝不一定分枝不一定分枝糖糖-肽键化学裂解肽键化学裂解肼解肼解稀碱水解稀碱水解聚糖内侧核心结构聚糖内侧核心结构都有分枝的五糖都有分枝的五糖Man3GlcNAc2有多种，除有多种，除GalNAc外，可外，可含含Gal或或/和和GlcNAc表4.3 N-聚糖与O-GalNAc聚糖的主要区别 血清糖蛋白多以血清糖蛋白多以N-N-糖肽键连接，因而糖肽键连接，因而N-N-聚糖聚糖又称为血清型又称为血清型(plasma type)(plasma type)。血清型聚糖均由。血清型聚糖均由一个共同的五糖核心和不同数量的外链组成。核一个共同的五糖核心和不同数量的外链组成。核心五糖结构如下：心五糖结构如

28、下：Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc1-AsnMan1Man1364.2.1.3 N-聚糖的结构根据核心五糖中两个-Man上连接的糖基，N-聚糖可分为三类：高甘露糖型（high- or oligo-mannose type) 、 复杂型（complex type）和杂合型（hybrid type）。 图图4.2 4.2 三种类型的三种类型的N-N-聚糖结构示意图聚糖结构示意图虚线框内为核心五糖。虚线框内为核心五糖。A.高甘露糖型；高甘露糖型；B.复杂型；复杂型；C.杂合型杂合型222334Asn23644Asn3/6363446Asn3/642423/642BAC664高甘露糖型复杂

29、型图图4.3 4.3 复杂型复杂型N-N-聚糖天线数及其位置聚糖天线数及其位置263Asn2463Asn42663Asn22663Asn24 26Asn26344 2C2C2二天线二天线C2,4C2三天线三天线C2C2,6三天线三天线C2,4C2,6四天线四天线C2,4C2,4,6五天线五天线图图4.4 4.4 N-N-聚糖外链结构示意图聚糖外链结构示意图见于见于1型糖链；型糖链；兼有兼有2，3和和 2，6 Sia的外链；的外链；1型型H抗原；抗原；无无Fuc1-2者为者为Lae抗原；有抗原；有Fuc1-2者为者为Leb 抗原；抗原；5Lea抗原；抗原；见于见于2型糖链；型糖链；常见的常见的唾

30、液酸化三糖外链；唾液酸化三糖外链；2型型H抗原；抗原；无无Fuc1-2者为者为Lxe抗原；有抗原；有Fuc1-2者为者为L ey抗原；抗原；(10)sLex 抗原；抗原；(11)仅存在于灵长类以下的哺乳动物；仅存在于灵长类以下的哺乳动物；(12)存在于少数糖蛋存在于少数糖蛋白外链中白外链中LNunitSO436333234233244333343/642434441112 4.2.1.4 O-聚糖的结构聚糖的结构 GalNAcGalNAc-O-Ser/Thr-O-Ser/Thr糖肽键最早发现于粘蛋白，因而糖肽键最早发现于粘蛋白，因而O-GalNAcO-GalNAc聚粘又称为粘蛋白型聚粘又称为粘

31、蛋白型(mucin(mucin type) type)。最简单情况。最简单情况Ser/ThrSer/Thr只连接一个只连接一个GalNAcGalNAc, ,见于不多几种粘蛋白和分泌性见于不多几种粘蛋白和分泌性糖蛋白中。少数糖蛋白中糖蛋白中。少数糖蛋白中Ser/ThrSer/Thr上连接一个二糖，包括上连接一个二糖，包括SiaSia2-6 GalNAc2-6 GalNAc- - ； GalGal1-3 GalNAc1-3 GalNAc- - ； GlcNAcGlcNAc1-3 GalNAc1-3 GalNAc- - ； GalGal1-3 GalNAc1-3 GalNAc- - 。含。含有两个以

32、上糖残基的有两个以上糖残基的O-O-聚糖可将其结构分为核心、骨架和聚糖可将其结构分为核心、骨架和非还原端三部分。非还原端三部分。(1) (1) 核心：核心： 与与N-N-聚糖都只有核心五糖不同，聚糖都只有核心五糖不同，O-GalNAcO-GalNAc聚糖至聚糖至少有少有7 7种核心结构，如图种核心结构，如图4.54.5所示；其中核心结构所示；其中核心结构较较为常见；核心结构为常见；核心结构和和分别是上述二糖分别是上述二糖和和；核心；核心和和有分枝有分枝。(2) 2) 骨架：骨架： 指核心结构外侧的延长部分，与指核心结构外侧的延长部分，与N-N-聚糖聚糖的外链相似，基本上由的外链相似，基本上由连

33、接的连接的Gal-GlcNAcGal-GlcNAc二糖二糖单位组成，包括单位组成，包括GalGal1-3 GlcNAc(11-3 GlcNAc(1型结构型结构) )、GalGal1-4GlcNAc(21-4GlcNAc(2型结构型结构) )和和(Gal(Gal1-4 1-4 GlcNAcGlcNAc1-3)1-3)n n以及以及N-N-聚糖中不存在的聚糖中不存在的Gal Gal 1-3 1-3 GalNAcGalNAc(3(3型结构型结构) )和和GalGal1-3 GalNAc1-3 GalNAc-(4-(4型结型结构构) )。O-GalNAcO-GalNAc聚糖骨架的聚糖骨架的Gal C6

34、Gal C6位常连有位常连有GlcNAcGlcNAc1-61-6分枝，如分枝，如GalGal1-4 GlcNAc1-4 GlcNAc1-1-3(Gal3(Gal1-4 GlcNAc1-4 GlcNAc1-6)Gal1-6)Gal1-1-结构，结构，i i抗原直抗原直链结构上如形成这种分枝就转变成链结构上如形成这种分枝就转变成I I抗原。抗原。 (3) (3) 非还原端：非还原端： O-GalNAcO-GalNAc聚糖的非还原端常是在聚糖的非还原端常是在GalGal上连一个上连一个SaiSai2-32-3或在或在GalNAcGalNAc上连一个上连一个SiaSia2-62-6。还有相当一。还有相

35、当一部分部分O-GalNAcO-GalNAc聚糖末端糖基被硫酸化，虽然糖链中部聚糖末端糖基被硫酸化，虽然糖链中部的糖基也可能被硫酸化。的糖基也可能被硫酸化。O-GalNAcO-GalNAc聚糖非还原端部分聚糖非还原端部分往往构成血型抗原，例如图往往构成血型抗原，例如图4.44.4中中和和分别为分别为1 1型型H H和和2 2型型H H抗原；抗原；则根据有无则根据有无FucFuc1-21-2分别为分别为L La ae e和和L Lb be e抗原；抗原；则按有无则按有无FucFuc1-21-2分别构成分别构成L Lx xe e和和L Ly ye e抗原。在抗原。在H-1H-1和和H-2H-2抗原

36、结构抗原结构GalGal上分别以上分别以1-31-3链连接链连接GalGal或或GalNAcGalNAc，就成为就成为B-1B-1、B-2B-2和和A-1A-1、A-2A-2抗原。抗原。4.2.2 糖蛋白的生物合成糖蛋白的生物合成 糖蛋白肽链部分的合成由特定基因转录的糖蛋白肽链部分的合成由特定基因转录的mRNAmRNA直直接编码，聚糖部分是后加的。接编码，聚糖部分是后加的。N-N-聚糖的合成在肽链合聚糖的合成在肽链合成 尚 未 完 成 时 即 已 开 始 ， 是 伴 翻 译成 尚 未 完 成 时 即 已 开 始 ， 是 伴 翻 译 ( c o -( c o -translational)tra

37、nslational)过程，过程，O-O-聚糖的合成则是翻译后聚糖的合成则是翻译后(post-translational)(post-translational)修饰过程。糖基化位点的选择、修饰过程。糖基化位点的选择、糖肽键的类型以及聚糖链的组成和结构，都是在基因糖肽键的类型以及聚糖链的组成和结构，都是在基因组编码的一系列特异性酶顺序作用下，在细胞内特定组编码的一系列特异性酶顺序作用下，在细胞内特定的微环境中形成的，因而可以认为聚糖链的合成受到的微环境中形成的，因而可以认为聚糖链的合成受到基因组严格而精准的间接控制。基因组严格而精准的间接控制。4.2.2.1 活化糖基供体的合成 所有的生物合成

38、都需要把单体事先活化，以利于所有的生物合成都需要把单体事先活化，以利于反应朝着合成的方向进行。聚糖链合成所需要的单糖反应朝着合成的方向进行。聚糖链合成所需要的单糖也必需转化成相应的活化形式，才能在糖基转移酶催也必需转化成相应的活化形式，才能在糖基转移酶催化下参入聚糖。蛋白质糖基化反应所需活化糖基供体化下参入聚糖。蛋白质糖基化反应所需活化糖基供体有三种类型：有三种类型：GlcGlc、GalGal、GlcNAcGlcNAc、GalNAcGalNAc、Xy1Xy1和和GlcAGlcA均为均为UDP-UDP-糖基；糖基；UDP-GlcAUDP-GlcA经表异构酶催化可转化经表异构酶催化可转化成成UDP

39、-IdoAUDP-IdoA；ManMan和和FucFuc为为GDP-GDP-糖基；糖基；SiaSia则以则以CMP-SiaCMP-Sia为活化供体；此外，为活化供体；此外，UDP-GlcUDP-Glc和和GDP-ManGDP-Man还能将糖基转还能将糖基转移到移到ERER膜中的膜中的DolDol-P-P上，以上，以Dol-P-GlcDol-P-Glc和和DolDol-P-Man-P-Man的的形式被糖基化反应利用。图形式被糖基化反应利用。图4.64.6简要概括了这些活化简要概括了这些活化糖基供体的合成路线与相互转化。糖基供体的合成路线与相互转化。图图4.6 4.6 活化糖基供体的生物合成及其相

40、应转化活化糖基供体的生物合成及其相应转化带阴影的矩形框为活化糖基供供；椭圆为单糖；星号处为控制点带阴影的矩形框为活化糖基供供；椭圆为单糖；星号处为控制点4.2.2.24.2.2.2 N-寡糖的合成 早在早在19601960年代至年代至19701970年代，利用重建的无细胞系年代，利用重建的无细胞系统和凝集素耐受细胞系阐明了统和凝集素耐受细胞系阐明了N-N-聚糖生物合成的基本途径。聚糖生物合成的基本途径。结果发现首先在结果发现首先在ERER中组装一个脂质载体连接的寡糖前体，中组装一个脂质载体连接的寡糖前体，再把这个寡糖前体转移到新生肽链合适的糖基化位点上，再把这个寡糖前体转移到新生肽链合适的糖基

41、化位点上，最后在最后在ERER和和GolgiGolgi器中经过一系列剪接加工，形成成熟的器中经过一系列剪接加工，形成成熟的糖蛋白。从糖蛋白。从19801980年代开始克隆年代开始克隆N-N-聚糖生物合成涉及的糖基聚糖生物合成涉及的糖基转移酶和糖苷酶的基因并延续至今。这些基因特殊的表达转移酶和糖苷酶的基因并延续至今。这些基因特殊的表达模式以及它们编码的酶突出的底物专一性为阐明模式以及它们编码的酶突出的底物专一性为阐明N-N-聚糖特聚糖特殊结构的形成与变化具有重要意义。还注意到胚胎发生、殊结构的形成与变化具有重要意义。还注意到胚胎发生、细胞活化和肿瘤形成等条件下细胞活化和肿瘤形成等条件下N-N-聚

42、糖的结构发生改变，为聚糖的结构发生改变，为研究研究N-N-聚糖的生物学功能提供了新的契机。聚糖的生物学功能提供了新的契机。C=CH3CHCH2(CH CCH3CH3=CHCH2 )nCH2CHCH3OCH2OCH3=PO图图4.7 4.7 多萜醇磷酸的结构多萜醇磷酸的结构O(1) (1) 多萜醇寡糖前体的组装：多萜醇寡糖前体的组装： N-N-聚糖的前体由聚糖的前体由1414个特定的单糖连接而成，在个特定的单糖连接而成，在所有真核细胞中这个寡糖前体的结构是保守的。寡糖前所有真核细胞中这个寡糖前体的结构是保守的。寡糖前体在磷酸多萜醇上组装体在磷酸多萜醇上组装( (图图4.7)4.7)。动物的多萜醇

43、含。动物的多萜醇含17172121个异戊二烯单元，真菌类和植物的多萜醇含有个异戊二烯单元，真菌类和植物的多萜醇含有14142424个个异戊二烯单元。多萜醇的极性端通过焦磷酸与糖相连接，异戊二烯单元。多萜醇的极性端通过焦磷酸与糖相连接，长长的烃链插入长长的烃链插入ERER膜，把正在合成的寡膜，把正在合成的寡 糖前体锚定在糖前体锚定在ERER膜上。膜上。 如图如图4.84.8所示，多萜醇焦磷酸寡糖前体组装的第所示，多萜醇焦磷酸寡糖前体组装的第1 1步反步反应由应由GlcNAc-1-GlcNAc-1-磷酸转移酶把磷酸转移酶把GlcNAc-PGlcNAc-P从从UDP-GlcNAcUDP-GlcNAc

44、上转上转移到给移到给DolDol-P,-P,同时释放同时释放1 1分子分子UMPUMP；然后再由；然后再由GlcNAcGlcNAc转移酶转移酶从从UDP-GlcNAcUDP-GlcNAc上把第二个上把第二个GlcNAcGlcNAc转移到转移到Dol-PP-GlcNAcDol-PP-GlcNAc上，上，同时释放同时释放1 1分子分子UDPUDP。接下来，在第。接下来，在第2 2步反应中由步反应中由5 5种不同的种不同的ManMan转移酶以转移酶以GDP-ManGDP-Man为糖基供体，依次添加为糖基供体，依次添加5 5个个ManMan。通过。通过尚不完全了解的机制，尚不完全了解的机制，Dol-P

45、P-GlcNAcDol-PP-GlcNAc2 2-Man-Man5 5穿越穿越ERER膜翻膜翻转到转到ERER腔腔( (步骤步骤3)3)。4 4个个GDP-ManGDP-Man在在ERER膜胞液一侧把膜胞液一侧把ManMan转移转移到到DolDol-P-P上，生成的上，生成的DolDol-P-Man-P-Man翻转到翻转到ERER腔（步骤腔（步骤4 4和和5 5）。）。在在ERER腔，腔，4 4种种ManMan转移酶以转移酶以DolDol-P-Man-P-Man为活化糖基供体，向为活化糖基供体，向Dol-PP-GlcNAcDol-PP-GlcNAc2 2ManMan5 5 再添加再添加4 4个

46、个ManMan残基残基( (步骤步骤6)6)。3 3个个UDP-GlcUDP-Glc在在ERER胞液一侧把胞液一侧把GlcGlc转移到转移到DolDol-P-P上，生成的上，生成的Dol-Dol-P-GlcP-Glc也翻转到也翻转到ERER腔腔( (步骤步骤7 7和和8)8)。最后，由。最后，由GlcGlc转移酶以转移酶以Dol-P-GlcDol-P-Glc为糖基供体添加为糖基供体添加3 3个个GlcGlc残基残基( (步骤步骤9)9)，完成，完成Dol-Dol-PP-GlcNAcPP-GlcNAc2 2 Man Man9 9 Glc Glc3 3 寡寡糖糖前前体体寡糖前体的组装。寡糖前体的组

47、装。 多萜醇焦磷酸寡糖前体的合成过程涉多萜醇焦磷酸寡糖前体的合成过程涉及拓扑变化。正如图及拓扑变化。正如图4.84.8所示，反应所示，反应1 1、2 2、4 4和和7 7都发生在都发生在ERER胞液一侧，反应胞液一侧，反应6 6、9 9和和1010都发生在都发生在ERER腔内。反应腔内。反应2 2形成的中间产物形成的中间产物和反应和反应6 6、9 9所需要的糖基供体都必需在所需要的糖基供体都必需在ERER膜中翻转到膜中翻转到ERER腔。尽管目前尚不清楚这种腔。尽管目前尚不清楚这种翻转移位的机制，但用糖基化抑制剂、内翻转移位的机制，但用糖基化抑制剂、内翻外的粗糙型翻外的粗糙型ERER囊泡进行的研

48、究都直接或囊泡进行的研究都直接或间接证明了上述中间产物翻转移位的事实。间接证明了上述中间产物翻转移位的事实。图4.8 多萜醇焦磷酸寡糖前体的合成途径(2) (2) 寡糖前体转移到新生肽链上：寡糖前体转移到新生肽链上： 上述完成组装的寡糖前体已具备了转移到新生肽链上的上述完成组装的寡糖前体已具备了转移到新生肽链上的条件，当肽链中出现合乎要求的条件，当肽链中出现合乎要求的AsnAsn残基残基(Asn-x-Ser/Thr(Asn-x-Ser/Thr) )时，包时，包括括1414个糖残基的寡糖前体整体转移，同时释放个糖残基的寡糖前体整体转移，同时释放1 1分子分子DolDol-PP-PP，再翻，再翻转

49、到转到ERER胞液面胞液面( (步骤步骤1010和和11)11)，其后经磷酸酶作用，其后经磷酸酶作用DolDol-PP-PP失去一个失去一个磷酸基，又变成磷酸基，又变成DolDol-P-P，可以参与下一轮寡糖前体合成，可以参与下一轮寡糖前体合成( (步骤步骤12)12)。 寡糖前体的转移是由寡糖前体的转移是由ERER膜中的寡糖转移酶膜中的寡糖转移酶(oligo-(oligo-sacharyl transfrasesacharyl transfrase, OST), OST)催化的。酵母催化的。酵母OSTOST复合物至少包含复合物至少包含9 9种种不同的亚基：不同的亚基：OstlpOstlp、O

50、st3pOst3p、Wbp1pWbp1p、Stt3pStt3p、Ost6pOst6p、SwplpSwplp、Ost2pOst2p、Ost5pOst5p和和Ost4pOst4p，所有这些亚基都是跨膜蛋白，有，所有这些亚基都是跨膜蛋白，有1 18 8个跨个跨膜域，其中膜域，其中Ost1pOst1p对其活性必不可少对其活性必不可少( (图图4.9)4.9)。寡糖前体末端的。寡糖前体末端的3 3个个GlcGlc显然是其转移信号，显然是其转移信号，OSTOST可识别其非还原端的可识别其非还原端的3 3个个GlcGlc和还原端和还原端的的GlcNAcGlcNAc，如果切掉最外侧的两个，如果切掉最外侧的两个

51、GlcGlc，其转移活性只剩下，其转移活性只剩下1/91/9；如将如将3 3个个GlcGlc全部切掉，就不能再被转移。全部切掉，就不能再被转移。OSTOST同样具备识别多肽链同样具备识别多肽链中合适糖基化位点的能力。中合适糖基化位点的能力。图4.9 ER膜上的OST复合物催化十四寡糖从Dol-pp-寡糖前体转移到新生多肽链中合适的Asn残基上OSTComplex60S40S(3) N-(3) N-糖链的加工和成熟：糖链的加工和成熟： 结合在肽链上的十四寡糖首先被结合在肽链上的十四寡糖首先被ERER中的葡萄糖苷酶中的葡萄糖苷酶切去非还原端切去非还原端Glc1-2Glc1-2残基，再由残基，再由-

52、葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶切切下另外下另外2 2个个GlcGlc残基。切除残基。切除GlcGlc不仅是开启后续加工的信号，不仅是开启后续加工的信号，而且与蛋白质折叠有关。如果糖蛋白折叠不适当，即可而且与蛋白质折叠有关。如果糖蛋白折叠不适当，即可被被ER ER 腔一种腔一种UDP-GlcUDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基转移酶识别并重：糖蛋白葡萄糖基转移酶识别并重新糖基化，带有新糖基化，带有Glc-ManGlc-Man9 9-GlcNAc-GlcNAc2 2寡糖的不当折叠蛋白寡糖的不当折叠蛋白质即可被质即可被ERER腔中的一种有糖结合活性的分子伴侣钙连蛋腔中的一种有糖结合活性的分子伴侣钙连蛋白白(caln

53、exin(calnexin) )识别并结合，然后结合于多肽链部分，把识别并结合，然后结合于多肽链部分，把十二寡糖的十二寡糖的GlcGlc1-3Man-1-3Man-暴露给暴露给-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶。- -葡萄糖酶葡萄糖酶和和UDP-GlcUDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基转移酶交替作用，：糖蛋白葡萄糖基转移酶交替作用，直至多肽链正确折叠。正确折叠的肽链糖基化位点附近直至多肽链正确折叠。正确折叠的肽链糖基化位点附近的疏水片段不再暴露，葡萄糖基转移酶不再结合，最后的疏水片段不再暴露，葡萄糖基转移酶不再结合，最后一个一个GlcGlc被切去，钙连蛋白解离，寡糖的加工继续进行被切去，钙连蛋白解离，寡糖的加

54、工继续进行( (图图4.10)4.10)。图图4.10 ER4.10 ER钙连蛋白钙连蛋白(calnexin(calnexin) )在糖蛋白的折叠中的功能在糖蛋白的折叠中的功能GlcaseGlcase和和为为-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶和和，Glc-T为为UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基转移酶：糖蛋白葡萄糖基转移酶 上述带有十一寡糖Man9-GlcNAc2-糖蛋白随即被ER中的-甘露糖苷酶切去核心糖1-6臂上的1-3分枝末端1-2连接的Man残基，生成的Man8GlcNAc2-Asn结构即可进入Golgi体继续加工。有些糖蛋白的Man8GlcNAc2-Asn结构可被一种特殊的N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移

55、酶识别，在两个1，2连接的末端Man内侧Man上各转移一个GlcNAc-P-基团，然后再由一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶切去GlcNAc,把磷酸基留在Man C6位。这种有Man-6-P的寡糖是糖蛋白被分拣和运输到溶酶体关键的结构信号。上述反应在ER/Golgi中确切的定位尚不明确。另一些糖蛋白则可在Golgi器-甘露糖苷酶作用下，切去以1-2连接的其余3个Man残基。 除上述逐步加工途径外，除上述逐步加工途径外，ERER中还有一种内切中还有一种内切- -甘露糖苷酶，可切除甘露糖苷酶，可切除Glc-ManGlc-Man9 9GlcNAcGlcNAc2 2-Asn -Asn 结构末端的结构末端的Gl

56、c1-3Man,Glc1-3Man,生成的生成的ManMan8 8GlcNAcGlcNAc2 2-Asn-Asn进进入入GolqiGolqi体，由其中的体，由其中的- -苷露糖苷酶苷露糖苷酶切去切去3 3个个1-21-2连接的连接的Man(Man(图图4.11)4.11)。图图4.11 ER4.11 ER和和GolgiGolgi体内体内N-N-寡糖的加工寡糖的加工GlcNAcGlcNAc-P-T:N-P-T:N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶；乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶；GlcNAcase:NGlcNAcase:N- -乙酰氨基葡萄糖苷酶。乙酰氨基葡萄糖苷酶。 在在GolgiGolgi体内，上述体内，

57、上述ManMan5 5GlcNAcGlcNAc2 2-Asn-Asn结构如继续结构如继续添加添加ManMan，可形成高甘露糖型，可形成高甘露糖型N-N-聚糖。如果由聚糖。如果由N-N-乙酰乙酰氨基葡萄糖基转移酶氨基葡萄糖基转移酶在核心结构在核心结构1 1，3 3臂的臂的ManMan上上添加一个添加一个1-21-2连接的连接的GlcNAcGlcNAc，或由，或由- -甘露糖苷酶甘露糖苷酶继续切除继续切除1-61-6臂上的两个臂上的两个ManMan，再添加适当糖基，可，再添加适当糖基，可形成杂合型形成杂合型N-N-聚糖。如果聚糖。如果ManMan5 5GlcNAcGlcNAc2 2-Asn-Asn

58、结构在结构在- -甘露糖苷酶甘露糖苷酶作用下切去作用下切去1-61-6臂上两个臂上两个ManMan，再由，再由N-N-乙酰氨基葡萄基转移酶乙酰氨基葡萄基转移酶添加添加1 1个个GlcNAcGlcNAc，产物再由，产物再由N-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶乙酰氨基葡萄糖基转移酶作用在作用在1-61-6连接的连接的ManMan上以上以1-21-2连接连接1 1个个GlcNAcGlcNAc，产物还可由岩藻糖基转移，产物还可由岩藻糖基转移酶在酶在AsnAsn连接的连接的GlcNAcGlcNAc上以上以1-61-6连接一个连接一个FucFuc, ,生成的生成的寡糖都可以成为复杂型寡糖都可以成为复杂型N-N-

59、聚糖的聚糖的“核心核心”部分部分( (图图4.12)4.12)。图图4.12 4.12 GolgiGolgi体中产生高甘露体中产生高甘露糖型、杂合型和复杂型糖型、杂合型和复杂型N-N-聚糖聚糖的基本途径的基本途径GlcNAcGlcNAc- T- T，-T-T：N-N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖转移酶转移酶， 上述复杂型上述复杂型N-N-聚糖聚糖“核心核心”在不同糖基在不同糖基转移酶作用下，顺序添加糖基，形成各具特转移酶作用下，顺序添加糖基，形成各具特点的聚糖链。图点的聚糖链。图4.134.13出示了几种双天线复杂出示了几种双天线复杂型型N-N-聚糖的合成路线，包括末端为聚糖的合成路线，包括末

60、端为1-31-3连连接的接的FucFuc、2-3/62-3/6连接的连接的SiaSia以及以及1-41-4连接连接的的GlcNAcGlcNAc 4-SO 4-SO4 4残基的外链。残基的外链。图图4.13 4.13 几种双天线复杂几种双天线复杂型型N-N-聚糖的合成聚糖的合成1-4GaT1-4GaT为为1-41-4半乳糖基转移半乳糖基转移酶；酶；1-4GlcNAc T1-4GlcNAc T为为1-4N-1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶；乙酰氨基半乳糖转移酶；1-3Fuc1-3Fuc为为1-31-3岩藻糖基转移岩藻糖基转移酶；酶；ST6 Ga1-1ST6 Ga1-1为为CMP-SiaCMP-Sia