基因工程复习题及参考答案

1、基因工程复习题及参考答案基因工程复习题及参考答案好好学习、天天向上1、什么是移动基因？移动基因又叫转位因子（transposable elements），它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁，也有称跳跃基因。（或控制因子、结合解离因子）2、什么是断裂基因？在编码序列中间插入无编码作用的碱基序列，从而使一个基因被分隔成不连续的若干区段的基因，这类基因被称为间隔或断裂基因。3、什么是假基因？是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。在真核生物中是很普遍存在，它形成的主要原因是小的碱基对缺失或插入以致不能正常编码。4、

2、什么是重复基因？即在基因组中有多个拷贝的基因。在真核生物基因组中发现这种现象，真核生物中的重复基因可以达到30%。重复基因主要是为了满足生物体快速发育的需要。5、什么是重叠基因？即多个基因共用碱基对的基因。重叠方式有完全重合叠，也有部分重叠。6、什么是基因工程？对DNA的遗传基因进行体外操作，把不同来源的基因按照单元设计的蓝图，重新构成新的基因组合，再把它引入细胞中，构成具有新的遗传特性的生物。7、基因工程的主要研究内容？（1）从复杂的生物有机体基因组中分离出带有目的基因的DNA片段。（2）体外连接重组DNA分子。（3）重组DNA分子转移到适当的受体细胞并增殖。（4）从大量的细胞群体中筛选获得

3、了重组DNA分子的受体细胞克隆。（5）从受体细胞克隆提取目的基因。（6）将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，产生出人类所需要的物质。8、核酸的凝胶电泳基本原理在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。FQE。（1）核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，DNA和RNA的多核苷酸链可叫多聚阴离子。（2）当核酸分子放置在电场中时，它就会向正电极的方向迁移。（3）由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，以同样的速度向正电极方向迁移。（4）在一

4、定电场强度下，DNA分子的迁移速度（电泳的迁移率）取决于核酸分子本身的大小和构型。（5）分子量较小的DNA，比分子量较大的DNA，具有较紧密的结构，其电泳迁移率较快，同时比同等分子量的松散型的开环DNA或线性DNA要快。9、脉冲电场凝胶电泳基本原理原由：随着凝胶的浓度降低，凝胶的孔径相应变大，故原则上，可用低浓度的琼脂糖凝胶分离高分子的DNA片段，但实验表明，即使浓度为0.1%0.2%的琼脂糖凝胶，亦不能分离分子量大于750kb的DNA大分子，此时，凝胶十分脆弱。（1）脉冲电场凝胶电泳，可分离分子量高达107bp的DNA大分子。（2）在电场中，DNA分子可随时调整其游动的方向，以适应凝胶孔隙的

5、无规则变化。（3）分子量较大的DNA需要更多次数更换其构型和方位，以使其可以按新的方向游动。故迁移速度要慢一些，从而达到分离超大分子量DNA的目的。10、核酸的分子杂交基本原理带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，如此形成的双链分子叫杂种核酸分子。11、DNA印迹杂交技术有2个主要过程：（1）将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；（2）固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。

6、该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。杂交流程：（1）待测核酸样品的制备：制备待测DNA；DNA限制酶消化。（2）琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品。（3）电泳凝胶预处理。（4）转膜：细管虹吸印迹法；电转移法；真空转移法。（5）探针标记。（6）预杂交（prehybridizafion）。（7）Southern杂交。（8）洗膜。（9）放射性自显影检测。12、RNA印迹杂交技术（1）RNA印迹杂交是一种检测已固定在滤膜上的总RNA或mRNA特定靶序列的技术。（2）由于RNA分子不能同硝酸纤维素滤膜结合，故不能直接用于RNA的吸附转移。

7、RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的活性滤膜上，通过共价交联作用而使它们永久地结合在一起。（3）DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为western blot。13、Western 印迹杂交技术将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫Western blotting 。14、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交技术是将被检标本点到膜上，烘烤固定，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈

8、斑点状或狭缝状，再进行杂交。15、菌落原位杂交是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。16、组织原位杂交组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交，而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。17、生物芯片的含义基因芯片是指采用原位合成或直接点样的方法将大量的D

9、AN片段或寡核苷酸 片段以预先设计的方式排列在硅片、玻璃等介质上形成微矩阵，待检样品用荧光分子标记后，与微距阵杂交，通过荧光扫描机计算机分析即可获得样品中大量的基因序列及表达信息，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。18、生物芯片的种类一般可分为两种类型：点印阵列、直接合成阵列。按载体材料分类：玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。按点样方式分类：原位合成芯片、微距阵芯片（分喷点和针点）和电定位芯片。按DNA种类分类：寡核苷酸芯片和cDNA芯片。按用途分类：表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片和毒理芯片。三维芯片PNA芯片19、基因导入细胞的常用方法（1）转化：是指一种细菌菌株由于捕获

10、了来自另一细菌菌株的DNA ，而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫给体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株叫受体菌株。（2）感染：噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染（infection）。（3）转染：重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染（transfection）。20、什么是转化21、什么是感染22、什么是转染23、什么是基因组细胞内遗传信息的携带者染色体所包含的DNA总体称为基因组。同一物种的基因组DNA含量总

11、是恒定的，不同物种间基因组大小和复杂程度则差异极大，一般讲，进化程度越高的生物体其基因组构成越大、越复杂。24、Sanger 双脱氧链终止法的原理（1）DNA的合成总是从5端向3'端进行的。（2）DNA的合成需要模板以及相应的引导核酸链。（3）DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3' 末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3',5'磷酸二酯键，使DNA链合成，产生短的DNA链。（4）测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；（5）在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，

12、产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。（6）这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列 。25、Maxam-Gilbert 化学修饰法原理（1）硫酸二甲酯(dimethylsulphate)是碱性化学试剂，能使DNA链中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位发生甲基化，在中性PH环境中就能使糖苷键发生水解，并引起DNA链的断裂。（2）肼(hydrazine)在碱性条件下，能特异性切割C和T。（3）1 mol/L的NaCl，只有C被特异性切割。如右图所示：26、基因化学合成的方法（1）磷酸二酯法合成寡核苷酸（方法1）原理

13、：将2个在5 或3 各带有适当保护性基团的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。化学合成的寡聚核苷酸链，可以通过逐步的缩合反应得以延长。为保证向3 - 5方向，其他碱基必须保护和消除保护。（2）磷酸三酯法合成寡核苷酸（方法2）与磷酸二酯法一样都使用了在单核苷酸的3或5端加保护基团的做法以防在这两个末端之间形成磷酸二酯键，但在磷酸三酯法中，参加缩台反应的单核苷酸是一种核苷3-单磷酸的衍生物。在它的磷酸分子上有一个羟基（POH）己经带上了适当的保护基团（通常是邻氯苯基和对氯苯基），因此事实上已经是一种磷酸二酯，而余下的另一个POH，仍具有反应活性，可以同另一个带有3-末端

14、保护基团之单核苷酸的5-OH缩合形成具磷酸三酯键的二核苷酸分子。（3）固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸（方法3）第一步，脱三苯甲基作用。用酸处理法除去与核苷酸1的5OH基团偶联的保护基团DMT。第二步，偶联反应。通过一种弱喊四唑的催化反应，使加进来的第二个核苷酸2同已附着在固相载体上的核苷酸1之暴露的5OH基缩合。第三步，封端反应，由加入的乙酸酐激发的乙酰化作用没反应的OH封闭起来。第四步，氧化作用。在核苷酸1和2之间新形成的亚磷酸三酯键十分活跃：利用碘液催化作用，使之被氧化成为相当稳定的磷酸三酯键。这四个步骤为一个循环周期。在下一个合成周期之前，要把附着在最后一个偶联核苷酸上的二甲氧基三苯甲基（

15、DMT）移去，以保证它的5端OH基团能够暴露出来，同下一个活化的脱氧单核苷酸进行偶联反应。DMT是一种显色指示剂，所以它的释放可以用来检测偶联反应的效率。合成终止时，固相载体上携带着被完全保护的寡聚脱氧核苷酸，因此需要使它们有系统地去掉保护基团，并从固相载体上释放出来成为游离的寡核苷酸。用乙醇沉淀法纯化这些寡核苷酸，再用凝胶电泳法使之进一步纯化，并同未完成的较短的片段分开，最后得到真正需要的产物。27、用寡核苷酸片段组装基因的方式利用长的寡聚体能够直接组装成长度为15002000bp的基因；遗憾的是用这种办法构建的基因，其突变频率相当高。平均每隔500一800bp就会出现一个突变。一种替代方法

16、是，把一个完整基因的全序列分解成少数几个片段。然后分别组装这些亚片段，经克隆验正其序列结构正确无误之后，再应用标准的克隆技术。将这些亚片段基因的正确顺疗连接在一起，最后得到所需的基因序列。如右图：28、寡核苷酸化学合成的实际用途（1）作为合成基因的元件。（2）作为核苷酸序列分析的引物。（3）作为核酸分子杂交的探针。（4）用于基因的定点诱变研究。（5）作为PCR扩增反应的引物。（6）作为重组DNA连接构件。29、基因的定点诱变与经典诱变的区别体外特异性改变某个碱基的技术叫做定点诱变。经典（古典）的方法是，用能够修饰DNA分子的化学诱变剂或物理诱变剂处理生物体。经典诱变特点：（1）经受诱变剂处理的

17、生物体它的任何基因都有可能发生突变，而目的基目的突变频率又可能相当低，因此突变体的筛选工作大。（2）即便分离到了具有期望表型的突变体，也无法证实突变确实就是发生在目的基因上。（3）无法知道究竟是在基因的什么部位发生了突变，是点突变还是片段插入等。30、盒式诱变、核苷酸引物诱变、PCR诱变的方法目前发展的定点诱变方法主要有：盒式诱变、核苷酸引物诱变、PCR诱变。（1）盒式诱变：是利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即所谓的寡核苷酸盒取代野生型基因中的相应序列；这种诱变的寡核苷酸盒是由两条合成的寡核苷酸组成。（2）核苷酸引物诱变：使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动单链

18、DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成的DNA子链的一个组成部分，因此所产生出的新链便具有已发生突变的碱基序列。为了使目的基因的特定位置发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基之外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。（3）PCR诱变：上述两种方法，其诱受能力仅限于靶DNA区段的5末端。而有时也希望对靶DNA的中心部位进行诱变，这就需要应用PCR定点诱变法。有重组PCR定点诱变法和大引物诱变法。三种方法如下图所示：盒式诱变核苷酸引物诱变重组PCR大引物诱变法31、 基因扩增的含义答：（为一特异蛋白质编码的基因的拷贝数选择性地增加而其他基因并未按比例增加的过

19、程。-网络释义）1、在体外应用聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）技术合成的寡核苷酸引物，导致特定基因的拷贝数发生快速大量的扩增。2、 通过体外DNA重组，将目的基因插入到高拷贝数的质粒载体分子上并转化到适当的寄主细胞中，于是在体内随着载体分子的大量复制，目的基因的拷贝数也得到了有效的扩增。3、在有些外界因子的胁迫下，真核生物的有关细胞被诱发产生适应性反应，从而导致相应的保卫基因产生明显的扩增。4、在生物的进化过程中发生的基因加倍与扩增，结果使相关的基因在基因组上聚集成簇。32、 PCR技术的基本原理答：PCR技术的基本原理：双链DNA分子在临近沸点的温度

20、下加热时便会分离成2条单链的DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新的DNA互补链。（特点：新合成DNA链的起点由引物决定。拷贝数为2n。）33、 PCR反应的基本条件及其对PCR的影响答：1、PCR反应的基本条件：引物、酶、dNTP、模板、Mg2+浓度； 2、PCR反应的基本条件对PCR的影响：（1） 引物：引物特异性，PCR结果的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由特异引物限定的，引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用。引物浓度，当PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性；引物浓度过高会促进引物的错误

21、引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶、dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低，每条引物的浓0.11umol或10100pmol。 （2）耐热DNA聚合酶：在PCR反应中，每100ul反应液中含1-2.5u TaqDNA聚合酶为佳；酶的浓度太低会使扩增产物产量降低；酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。（3）三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：dNTP是DNA合成的基本原料，PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性；过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入。一般认为最适的dNTP浓度为50200umol/L

22、。（3）模板核酸：PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。（4）Mg2+：Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；Mg2+浓度过过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L；对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。34、 PCR技术的应用方面答：1、核酸的基础研究：基因组克隆 ；2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA

23、测序；3、反向PCR测定未知DNA区域；4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA；5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控；6、cDNA末端快速扩增技术；7、检测基因的表达；8、在医学方面：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学等。35、什么是DNA迁移率变动试验答：DNA迁移率变动试验(DNA mobility shift assay，EMSA)，又叫凝胶阻滞(gel retardation)试验，是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的特殊的凝胶电泳技术。36、 凝胶阻滞试验的原理答：凝胶阻滞试验的原理：

24、在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA 片段，将其与蛋白质混合后，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA与特异性蛋白质结合其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白。将该实验改进，DNA 与更多的蛋白结合移动速度进一步减慢，这种方法又称超级迁移率变动试验(supershiftassay)。37、 DNase 足迹试验的原理答：DNase足迹试验的原理为：蛋白结合在DNA 片段上保护结合部位不被DNase破坏，这样蛋白质在DNA片段上留下了足迹在电泳凝胶的放射性自显影图片上相应于蛋白质结

25、合的部位没有放射性标记条带。38、 基因工程操作的基本条件答：基因工程操作的基本条件：1、用于核酸操作的工具酶；2、用于基因克隆的载体；3、用于基因转移的受体菌或细胞。39、 什么是RNase、DNase答：RNase叫做核糖核酸酶，是专门水解断裂RNA分子的酶。DNase叫做脱氧核糖核酸酶，是特异断裂DNA分子的酶。通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。40、 影响核酸内切限制酶活性的因素答：核酸内切限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它主要从原核生物中分离纯化出来

26、的。影响核酸内切限制酶活性的因素：1、DNA的纯度；2、DNA的甲基化程度；3、酶切消化反应的温度；4、DNA的分子结构；5、溶液中离子浓度及种类；6、缓冲液的pH值。41、 DNA连接酶的特性答：能催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶叫DNA连接酶。DNA连接酶的特性：1、DNA连接酶并不直接连接两条单链的DNA分子，或环化单链DNA分子。2、是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口，而不是封闭裂口。3、DNA连接酶的来源：由大肠杆菌染色体编码的叫DNA连接酶；由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶。4、连接酶的最佳反应温度为37 ，但粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，只有几个碱基配

27、对，一般认为415 比较合适。方法1：用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段。方法2：用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)-poly(dT)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。方法3：先在DNA片段末端加上化学合成的接头，使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶将它们连接起来。三种方法的共同点是：利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。42、 平末端的连接的方法答：DNA连接酶不具备催化连接平末端的DNA片段，除非DNA十分稠密。T4DNA连接酶除DNA连接酶的性质外，在ATP和高浓度酶的作用

28、下，能连接具有完全碱基配对的平末端的DNA分子，但目前机制不清楚。平端连接的效率是比较低的，一般通过提高DNA的浓度或增加连接酶的用量可提高平端的连接效率，有时也可采取在平端加上合成的接头的方法，产生粘性末端，也可以提高连接的效率。主要有：方法一：同聚物加尾法（利用核酸外切酶处理后，再在末端核苷酸转移酶（能将dNTP加在DNA单链延伸末端的3端的-OH上，其特点不需要模板的存在）的作用下，在一端只有一种碱基存在下形成同类型的尾巴（长度可达100bp，一般在1040bp）方法二：衔接物连接法（用化学方法合成的由1012bp组成有具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的DNA片段，再连接。）方法三：

29、DNA接头连接法。43、 什么是LCR答：连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)，是一种新的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。44、 DNA聚合酶的特点答：DNA聚合酶的特点： 1、以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA； 2、需要模板和引物的存在； 3、不能起始合成新的DNA链； 4、催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端； 5、催化DNA合成的方向是5'3'。 （T4DNA聚合酶与大肠杆菌DNA聚合酶相比的特点：1、它无5'3'外切酶活性； 2、它需要一条有引物的单链DNA

30、作模板。T4 噬菌体DNA 聚合酶与Klenow 酶相似：但3'-5' 外切活性强200 倍，且不从单链DNA模板上替换引物，因此在诱变反应中更有用，诱变率约提高1 倍。Taq DNA聚合酶：是一个耐热DNA聚合酶，具有5'3'聚合酶活性和双链DNA特异性的5'3'外切酶活性。）45、 磷酸酶的作用答：磷酸酶的作用是：将DNA末端中的5-端磷酸基除去，使其5-端变成了OH基。该酶有2个主要的用途：一是将载体末端的磷酸基除掉，避免在DNA重组时载体分子的自我连接；另一用途就是和T4多聚核苷酸激酶联用，用于DNA的末端标记。46、 末端脱氧核苷酸转移

31、酶的作用答：末端脱氧核苷酸转移酶作用：在DNA载体和cDNA末端加互补同聚物尾巴或3末端标记。（分离自小牛的胸腺，该酶催化将dNTP重复添加到一个DNA链的3-OH末端；核苷酸的聚合不依赖于模板。）47、 载体的功能答：载体的功能：1、运送外源基因高效转入受体细胞；2、 为外源基因提供复制能力或整合能力；3、 为外源基因的扩增或表达提供条件。48、 载体应具备的条件答：载体应具备的条件：1、具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；2、具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；3、长度尽可能小，以提高其载装能力；4、具有多种单一的酶切位点；5、具有合适的选择性标记。49、 质粒的一般生物

32、学特性答：（1）自主复制性：质粒DNA含有自己的复制起始点以及控制复制频率的调控元件，即复制子（replicon）结构，使质粒DNA能够摆脱宿主染色体DNA复制调控系统而进行自主复制（autoreplication）。（2） 不相容性：具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称为质粒的不相容性(incompatibility)。（3） 转移性：在天然条件下，很多质粒可以通过细菌接合作用从一个宿主细胞转移(transferability)到另一个宿主细胞，甚至另一种亲缘关系较近的宿主菌。（4）选择标记：编码产物赋予细菌某些性状特征（5）可自行丢失与消除

33、。50、碱变性法提取质粒DNA的基本原理答：1、染色体DNA 分子量比较大，在碱性环境中（高 pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。2、质粒DNA 分子量小，在碱性环境中（高pH），双链解旋，但不拆开，当pH恢复中性时，恢复成环状。由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。51、 如何对含有Ampr Tetr和Ampr Tets转化子进行筛选答：采用环丝氨酸富集法对含有Ampr Tetr和Ampr Tets转化子进行筛选。具体操作：1、将转化混合物涂布在含氨苄青霉素的LB培养基

34、上，37°C培养12h；2、取上述培养基，挑取单一菌落（含有Ampr）于含有氨苄青霉素的培养液中摇菌培养适宜时间，取适量菌液涂布于含四环素和环丝氨酸的选择培养基中，37°C培养12h，长出的菌落即为含有Ampr Tets的转化子。原理：1、四环素通过抑制细胞蛋白质的合成，迫使细胞停止生长，但不会导致细菌死亡（抑菌性抗生素）； 2、氨基酸的类似物：环丝氨酸，如果在细胞分裂生长过程中参入到新合成的蛋白质多肽链，将导致细菌死亡。结果：1、在四环素培养基中：环丝氨酸能杀死生长的Tet r细胞，环丝氨酸不能杀死生长的Tet s细胞 ；2、Tet r基因内插入外源DNA，成为Tet s

35、，进入大肠杆菌，环丝氨酸处理，Tet s细胞数明显上升，得到富集。（四环素Ter、氨苄青霉素Amp，若质粒对氨苄青霉素有抗性-Ampr）52、 质粒载体不稳定性的类型答：1、结构的不稳定：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失。 2、分离的不稳定：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体。53、 pUC质粒转化子筛选的机制答：pUC质粒载体是在PBR322质粒载体的基础上，组入一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，能水解乳糖的结构类似物：5溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（x-gal，无色），但当它被lacZ的基因产物水解后形成游离

36、的5'溴-4-氯吲哚，这种化合物在中性pH下呈蓝色所以凡接受pUC18/19质粒的大肠杆菌菌落均呈蓝色。54、 什么是穿梭质粒答：穿梭质粒是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以携带着外源DNA序列在不同物种的细胞之间，特别是在原核和真核细胞之间往返穿梭，故称穿梭质粒。55、 什么是噬斑答：一个空斑系由一个噬菌体复制增殖并裂解细菌后形成，称为噬斑(plaque)，不同噬菌体噬斑的形态与大小不尽相同。56、 噬菌体的溶菌生命周期答：1、吸附：吸附于大肠杆菌外膜上的受体（正常功能是运转麦芽糖进入细胞内），麦芽糖

37、可诱导这些受体的合成，故它也可促进噬菌体的吸附与感染（尾部吸附）。2、 注入：吸附之后，线状DNA通过尾部的管道被注入大肠杆菌细胞内，碱基配对形成环状结构。3、合成：从单一ori区滚筒复制，形成线状多联体，DNA上两个基因的产物激活复制的起始，但复制所需的蛋白因子系统则由宿主细胞提供。4、组装：包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，因此cos区对包装是至关重要的。5、释放：每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。57、什么是

38、COS末端答：COS末端即为粘性末端，指基因组DNA其两端的5末端带有12 个碱基的互补单链（12 个碱基的序列为5-GGGCGGCGACCT-3）。58、 什么是原噬菌体答：进入细菌的DNA可整合(integrate）入细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的DNA称为原噬菌体(prophage)、前噬菌体。（DNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。）59、 什么是溶源菌答：含有原噬菌体的细菌称为溶源菌(lysogen)。61、体外包装：重组DNA分子在加入含有完成噬菌体包装所需的所有蛋白质的细菌细胞抽提

39、物时，它们能被组装成噬菌体颗粒，此过程叫做体外包装 。62、-DNA 作为载体的优点-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌；-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为23kb，远远大于质粒的装载量；重组-DNA的筛选较为方便 ；重组-DNA分子的提取比质粒容易。63、柯斯质粒：是含有 -DNA两端cos区的质粒，是用正常的质粒同噬菌体的cos位点构成。64、 柯斯质粒载体的特点1、具有噬菌体的特性：（1）重组外源片段后，在体外包装成噬菌体颗粒，可以高效转入寄主细胞大肠杆菌；（2）重组柯斯质粒载体进入细胞后能环化；但由于不含有噬菌体的全部必要基因，不能通过溶菌周期形成子代噬菌体。2

40、、具有质粒载体的特性：（1）具有质粒复制子，能够象质粒一样在细胞内复制；（2）在氯霉素的作用下进一步扩增；（3）具有抗菌素抗性标记或基因插入失活的克隆位点。3、具有高容量的克隆能力：（1）由于是质粒+cos位点，其分子量较小，一般为57Kb；（2）插入外源片段能力大（上表中数据表明）。4、具有与同源序列的质粒进行重组的能力。65、 M13-DNA 作为载体的优点及用途1、最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链，单链DNA的用途：（1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序（2）用于单链DNA的定点诱变（3）用于合成探针2、筛选方便感染的受体细胞生长缓慢，形成浑浊圈，易于挑选辨认而且重组分

41、子越大，浑浊圈的浑浊度亦越大，这样可以直接辨认哪些菌落含有的外源DNA片段，哪些含有小的。66、噬菌粒：是由单链噬菌体M13与质粒载体重组而成的新型载体。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。67、基因克隆的过程1、用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分子的片段化；2、外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；3、将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞的程序；4、获得了重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。68、基因文库：是含有某种生物体

42、全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。69、 蔗糖梯度离心分离 DNA 的原理蔗糖的最大密度是1.3g/cm3，离心分离密度大于1.3g/cm3的样品，如DNA、RNA时会沉积在离心管的底部，从而与其他低密度的杂质分离开。如要进一步分离，需要使用密度比蔗糖大的介质。重金属盐氯化铯(CsCl)是目前使用的最好的离心介质，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度，并能保持稳定。在氯化铯形成的密度梯度中，离心管顶部的密度为:1.65g/cm3，底部为:1.75g/cm3。DNA的密度是1.70g/cm3，会停留在离心管的中部。70、 连接反应的注意事项 （1）阻止线性载体分子的自身环化（2）正确调整载体

43、分子和外源分子的比例（3）控制DNA的总浓度（4）注意温度对连接反应的影响。71、基因克隆的实验方案：是指主要内容为cDNA基因克隆、基因组DNA克隆、基因定位克隆等基因克隆的操作方法和步骤。72、 cDNA 文库的优点(1)用RNA病毒可建立文库；(2)因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；(3)从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。(4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。73、 寡聚脱氧核苷酸引导法合成全长双链 cDNA 的方案首先，第一链的合成，以mRNA为模板在反转录酶的作用下，以oligo（dT）为引物dNTPs为底物合成cDNA，并用末端转移酶在杂交双链

44、的两端增加粘性末端；然后，水解模板mRNA，碱性蔗糖梯度离心回收全长cDNA；最后，第二链的合成，以oligo（dG）为引物dNTPs为底物合成cDNA互补链形成双链DNA分子。双链合成后可通过同聚物加尾或加衔接物的办法插入载体分子。74、基因组 DNA 克隆的方案基因组的克隆方案：PCR扩增获取全长基因组片段PCR产物纯化回收根据基因组片段的大小及酶切位点的特征等选择合适的连接载体（对于一些极大的基因组，如真核基因组可先通过机械破碎或酶切使之成为一定大小的片段）一般可通过头衔物连接法或酶切法将基因片段连接到噬菌体（需进行体外包装形成具有高效感染性的噬菌体颗粒）或者质粒上转化进入受体细胞利用特

45、殊噬菌斑或者氨苄青霉素抗性、Lac Z 基因的互补筛选进行重组体筛选重组-DNA分子或质粒的提取PCR技术进行筛选确定将阳性重组体送往公司测序。完整的基因组文库（ genomic library ）是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA 克隆群体，构建文库时先将基因组 DNA 通过机械剪切随机打断（使用hydroshear 或超声波细胞粉碎仪）或酶切使之成为一定大小的片段，与适当的载体重组、克隆。例1：通过衔接物连接法在噬菌体上构建基因组文库。例2：用Sau3A限制酶消化真核基因组DNA在噬菌体载体上构建基因组文库。细菌人工染色体(bacterial artificial chrom

46、osomes， BAC， fosmids) 基础：大肠杆菌F质粒导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记 供体DNA大小：>300kbp。主要应用：大基因组分析 载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量供体DNA。BAC 载体空载时大小约 7.5kb ，在大肠杆菌中以质粒的形式复制，具有一个氯霉素抗性基因。外源基因组 DNA 片段可以通过酶切、连接克隆到 BAC 载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。装载外源 DNA 后的重组质粒通过氯霉素抗性和Lac Z 基因的 互补筛选。75、 定位克隆：通过遗传标记 ，先获得某一表型基因在染色体上的定位 ，再在

47、候选区域内选择已知基因 ，进行致病突变的筛选 ，并获得cDNA及全基因。76、提高探针的特异性的方法1、选基因的特异序列为探针；2、长度不低于1720nt；3、控制退火温度。77、应用差别杂交法分离克隆的目的片段的方案首先，从表达目的基因的细胞中提取mRNA分别制备带有放射标记的cDNA探针和反转录制备cDNA，合成得到双链DNA后重组到载体上转染E.coli构成cDNA文库；然后，从不表达目的基因的细胞中提取mRNA制备带有放射标记的cDNA探针；最后，将影印有E.coli菌落的NC膜分别与两种带有放射标记的cDNA探针进行杂交，对比找到具有差别的菌落杂交单位作为可能的克隆目的片段。78、基因的差别表达：在生物个体发育的不同阶段、或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，叫做基因的差别表达。79、应用 mRNA 差别显示技术分离克隆的目的基因的原理以一种与mRNA的poly（A）结合的寡聚核苷酸序列作为锚定引物，进行反转录，形成mRNAcDNA的杂交分子。再加入另一短的随机序列作为随机引物，进行PCR反应。随机引物可与反转录成的单链cDNA相结合，随机进行PCR，最后用聚丙烯酰胺凝胶显示扩增片段。80、为什么克隆基因需要选择与鉴定因为，通过克隆后形成的DNA分子可能包括以下类型：1、仅载体分子2、仅数个外源D