生命科学研究进展论文

1、RNA干涉及其应用摘要 RNA干涉（RNAi）是将双链导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程.它是转录后基因沉默的一种。RNAi发生过程主要分为3个阶段:起始阶段，扩增阶段，效应阶段。RNAi在生物界中广泛存在.综述RNAi现象的发现、发生机制及其应用,并展望未来的研究.关键词 RNA干涉 RNA干涉应用RNA interference and its applicationAbstract Introduction of double-stranded RNA into cells can induce specific mRNA degradation. This proces

2、s is called RNAinterference(RNAi). It is a kind of post-transcriptional gene silencing. RNAi patlway can be divided into three step: initiation step, amplification step and effector step . RNAi exists in a wide variety of organisms. The discovery , mechanism and application were reviewed in the pape

3、r . In addition, the out look of RNAi was introduced .Key words RNA interference application RNA 干涉(RNA interference ,简称RNAi) 是将双链RNA(dsRNA) 导入细胞引起特异基因mRNA 降解的一种细胞反应过程.它是转录后基因沉默(PTGS)的种.1998 年, Fire 等人1 在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现,由正义和反义RNA 退火形成dsRNA 引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义RNA 强10 倍以上.dsRNA 引起的基因表达抑制不是正义或

4、反义RNA 引起的基因表达抑制在数学上的叠加,这就说明dsRNA 触发了细胞内的一些反应机制,从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果. 当时,他们就把这种现象命名为RNA 干涉.RNAi 最早是在线虫C.elegans 上发现的1 .此后,人们发现在水蛭、锥体虫、涡虫、果蝇等无脊椎动物RNAi 都非常有效. 并且线虫和果蝇成为研究RNAi 的两个最常见的模式生物. 然而,在脊椎动物RNAi 研究却呈现阶梯式的发展. 开始,较长dsRNA(大于30 bp) 只能引起少数胚胎细胞(如斑马鱼和小鼠胚胎) 的RNAi 现象2 .然后,人工合成的21 nt 长的RNA 二合体(又称为smallinter

5、fering RNA ,简称siRNA) 在培养的哺乳动物细胞(如人胚肾293 细胞和HeLa 细胞) 成功进行了RNA 干涉3 .最近,利用载体表达的small hairpin RNA(shRNA) 在许多培养的人源,猴源和鼠源的哺乳动物细胞的RNAi 实验取得了成功4 . RNAi不仅存在于动物界,它还存在于植物界.在RNAi发现以前,人们已经发现,当植物被转移一个体内业已存在的基因以后,该基因的表达水平不但不升高,反而出现降低,这种现象在植物学中称之为共抑制(cosuppression).同样,转基因引起真菌的基因沉默现象被人们称之为quelling. RNAi发现以后,人们相继在烟草5

6、 和拟南芥6 等植物证明dsRNA 可以引起植物的RNAi 现象. 由此可见,RNAi 是生物界广泛存在的一种现象. 许多和共抑制、quelling 相关的基因也和RNAi 相关,这也说明共抑制、quelling 和RNAi 等依赖同源序列的基因沉默有可能沿用了同一个反应机制.1.RNAi 作用机制近年来研究发现,干扰性小RNA( small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA) 是RNA 干扰作用(RNAi) 赖以发生的重要中间效应分子. siRNA 是一类长约2125 个核苷酸( nt ) 的特殊双链RNA(dsRNA) 分子,

7、具有特征性结构,即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 两条单链末端为5端磷酸和3端羟基. 此外,每条单链的3端均有23 个突出的非配对的碱基( Fig.1) 35 Fig.1 The tructure of siRNARNAi 的主要过程是,dsRNA 被核酸酶切割成2125 nt 的干扰性小RNA ( siRNA) ,由siRNA 介导识别并靶向切割同源性靶mRNA 分子. 细胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步. 细胞中dsRNA 可通过多种途径形成,如基因组中DNA 反向重复序列的转录产物;同时转录反义和正义RNA ;病毒RNA 复制中间体;以及以细

8、胞中单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA等. 在线虫( C. elegans) 可以直接注射dsRNA 或把线虫浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,还可以通过喂养表达正义和反义RNA 的细菌获得dsRNA6 .现已初步阐明RNAi 的作用机制6 . RNAi 的第一步是,dsRNA 在内切核酸酶(一种具有RNase 样活性的核酸酶)作用下加工裂解形成2125 nt 的由正义和反义序列组成的干扰性dsRNA ,即siRNA.果蝇中RNase III 样核酸酶称为Dicer. Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以

9、及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在Arabidopsis , C. elegans , Schizosac2charomyces pombe 以及哺乳动物中也存在Dicer 同类物. RNAi 的第二步是,由siRNA 中的反义链指导形成一种核蛋白体,该核蛋白体称为RNA 诱导的沉默复合体( RNA induced silencing complex , RISC) , 由RISC 介导切割靶mRNA 分子中与siRNA 反义链互补的区域,从而达到干扰基因表达作用. RISC 由多种蛋白成分组成,包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 链搜索活性等. 线虫C. elega

10、ns 中的MUT7 (一种RNase D 样蛋白) 可能是一种352 外切核酸酶. 此外, PAZPPiwi 蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分,如Arabidposis 中的AGO1; N.Crassa 中的QDE2;C. elegans 中的RDE1 等,以上这些蛋白与翻译因子eIF2C 同源.最新的研究5 进一步揭示,ATP 在siRNA 介导RNAi 中具有重要作用. 较长dsRNA 向siRNA 的转变要有ATP 参与. siRNA与蛋白因子形成一个无活性的约360 kD 的蛋白PRNA 复合体;随之, siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA 复合体(RISC) ,此步

11、具有ATP 依赖性. RISC 活性复合体对靶mRNA 的识别和切割作用,这一步可能不需ATP参与. 此外,ATP 使siRNA 5端带上磷酸分子,且对siRNA 的功能具有重要作用. 上述过程中siRNA 双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它辅助因子,含有siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA 分子.siRNA 可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可进入上述循环. 这种过程称为随机降解性

12、多聚酶链反应(random degradative PCR) . 新生的dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的siRNA ,从而使靶mRNA 渐进性减少,呈现基因沉默现象7 . RdRp 一般只对所表达的靶mRNA 发挥作用,这种在RNAi 过程中对靶mRNA 的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能. 每个细胞只需要少量dsRNA 即能完全关闭相应基因表达,可见 RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征9 2.RNAi 的应用2.1探索基因功能的有力工具随着多国科学家参与的人类全基因组计划进入尾声,一个以揭示蛋白质结构与功能为重点的后基因组时代业已拉开序幕. 由于RNA

13、i 可以使特异基因mRNA 发生降解,从而获得特定蛋白功能丧失或降低的突变株. 因此,RNAi 可以作为一种强有力的研究工具,用于后基因组的研究. 而与其他几种进行功能丧失的技术相比,RNAi 技术具有明显的优点,它比反义核酸技术有效,比基因敲除简单.线虫全基因组已于1998 年测序完毕,RNAi 的发现又为系统和高通量研究线虫全基因组功能提供了可能. 它的实验方法是:先用PCR 方法或反转录方法大规模获得基因库,直接体外或体内转录生成dsRNA,再用显微注射、浸泡或喂养的方法导入线虫,然后用解剖显微镜或微分干涉差显微镜观察RNAi 表型变化。Hyman 实验室10 系统分析了线虫号染色体的2

14、174个基因(占总基因的96 %) ,其中281 个基因产生了RNAi 表型. Kemphues 实验室11分析了350 个卵细胞cDNA 基因,其中81 个基因在胚胎生成中有重要作用.Sugimoto 实验室12 分析了2479个cDNA 基因,其中675 个基因有表型变化. Ahringer 实验室13 分析了线虫I 号染色体的2416个基因(占总基因的87 %) ,其中339个基因产生了明显的RNAi 表型. 目前已探索了几乎整个线虫的所有基因(约19000个).植物的全基因组探索也正在进行中.2.2用于基因治疗RNAi 的作用具有高效率和高特异性的特点,它能使目标蛋白的mRNA 发生特

15、异性的降解. 因此,RNAi 是基因沉默疗法的理想工具.目前,人们已经证明在培养的哺乳动物细胞中,RNAi 可用于抗病毒和抗肿瘤等的基因治疗.Novina 等13 实验表明,合成的siRNA 可特异性地沉默HIV21 细胞受体CD4 ,病毒结构蛋白Gag 和调节蛋白Nef .HIV21 复制周期的每一个环节都可以受到siRNA 的有效抑制13 .Gitlin 等14发现,用siRNA 预处理的人或鼠细胞能够抵抗脊髓灰质炎病毒感染并利于已感染脊髓灰质炎病毒细胞的病毒的清除. Wilda 等14 在K562 细胞系(慢性髓细胞性白血病) 用针对融合基因bcrabl 的dsRNA 可以明显引起细胞凋

16、亡. 随着RNAi 被成功地应用于哺乳动物细胞,进而用于人类疾病的治疗已为期不远.2.3新药物的研究与开发蛋白质是细胞功能的执行者,各种疾病的发生和蛋白质功能的异常是分不开的. 虽然人类全基因组序列已被揭示,但是蛋白质功能的研究仍然任重而道远. 这也给药物的研制与开发带来了巨大的挑战. RNAi 不仅可以使细胞产生特定基因“Loss of function”表型,而且它还具有高效和特异的特点. 因此,它在新药的开发与研究上具有广阔的前景. 比如RNAi 可以作为寻找新的药物靶标的工具13 ,可以高通量地对发现的药物靶基因做功能分析,可以帮助了解药物作用的生化模式等. 美国Genetica 公司

17、已将RNAi 技术作为高通量药物靶标识别和确认的工具. 另外,比利时Devgen 公司也已建立了一个覆盖全基因组的线虫RNAi 文库,只需通过喂饲含该文库的食物就可以观察到线虫表型的改变,这大大方便了药物靶标的识别和确认工作.3.展望自1998 年RNAi 发现以来,它已成为生命科学研究的一大热点, 并且有着十分诱人的应用前景. 它不仅能极大推进基因组功能的研究,还能利用设计的RNAi 芯片,进行高通量筛选靶基因药物,而且在研究信号传导通路、基因治疗等方面开辟了新的途径. 但仍然有许多问题有待进一步阐明.例如,不同种的生物是否沿用同一种RNAi机制？RNAi 机制本身又受到哪些基因调控?今后对

18、RNAi 的研究可能会沿着以下方面发展: RNAi 具体分子机制研究;RNAi 生物功能研究;RNAi 技术在功能基因组学、基因治疗和植物品质改良、药物开发等许多领域的应用研究.参考文献1 Fire A , Xu S , Montgomery M K, Kostas S A , Driver S E , Mello C C.Potent and specific genetic interference by double2stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature , 1998 , 391(6669) : 8068112 Wianny F ,

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20、ure , 2001 , 411 : 4944984 Brummelkamp T R , Bernards R , Agami R. A system for stableexpression of short interfering RNAs in mammalian cells.Science ,2002 ,296(5567) :5505535 何承伟, 刘 芳, 刘新光, 等. RNA 干涉作用机制的研究进展J . 医学综述, 2005 , 11 (4) : 291-294 6 Chuang C F , Meyerowitz E M. Specific and heritable gen

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