RGQ安装时应用培训

1、Sample & Assay Technologies- 1 -The Rotor-Gene Q应用培训Sample & Assay Technologies- 2 -n5 种型号，满足不同的需要oRotor-Gene Q 2Plex oRotor-Gene Q 2Plex HRM oRotor-Gene Q 5Plex oRotor-Gene Q 5Plex HRM oRotor-Gene Q 6Plex产品概况产品概况工作过程Sample & Assay Technologies- 3 -旋转模式旋转模式 仪器运行时转盘速度 400 RPM (加热和冷却) 高速数据收集 样品旋转一次，数据

2、收集一次 (0.15 sec) 重力作用让试剂都在管底 除去气泡和浓缩 组分不会形成沉淀持续运动保证无差异 孔与孔间的温度和光学400 RPM10 GSample & Assay Technologies- 4 -离心式鼓风机混匀腔体内的空气腔体门关上，密封腔体内的空气转盘上的孔能让空气自由通过升温升温加热开Sample & Assay Technologies- 5 -空气进离心式鼓风机把空气吸入腔体内腔体门打开，排出热空气加热关转盘上的孔能让空气自由通过降温降温离心式鼓风机混匀腔体内的空气Sample & Assay Technologies- 6 -光学通路光学通路Sample & As

3、say Technologies- 7 -光学通路光学通路激发光发射光Sample & Assay Technologies- 8 -PCR 转子和转子和PCR管类型管类型 136 孔转子孔转子- 适用 0.2 ml 平盖 PCR 管-推荐反应体积20 50 L 72 孔转子孔转子- 适用 0.1 ml PCR连管-推荐反应体积10 50 L -#981005；#981008-#981103；#981106Sample & Assay Technologies- 9 -转盘转盘 72- 72 个样品-Rotor-Disc 72，管容积50 L -推荐反应体积20 25 L -需要密封膜和加热器

4、转盘转盘 100- 100个样品-Rotor-Disc 100，管容积30 L-推荐反应体积15 25 L -需要密封膜和加热器加热器，#9019725Rotor-Disc 72，# 981301Rotor-Disc 100，# 981311密封膜，#981601PCR 转子和转子和PCR管类型管类型 2Sample & Assay Technologies- 10 -加热器加热器用来密封 Rotor-Disc密封后不能取下工作流程预热取下膜中间的封纸把膜放在 Rotor-Disc正上方放进入加热器中，拉下压杆等警报音响，从加热器中取出注意 至少放置10秒冷却把膜多余的部分撕走小心地从加热板上

5、取下Rotor-DisckSample & Assay Technologies- 11 -开始开始点击此图标运行设置运行设置Sample & Assay Technologies- 12 -运行设置运行设置 - Quick Start 模式模式选择模板Sample & Assay Technologies- 13 -运行设置运行设置 - Quick Start 模式模式选择转子Sample & Assay Technologies- 14 -运行设置运行设置 - Quick Start 模式模式确定步骤之HoldSample & Assay Technologies- 15 -运行设置运行设

6、置 - Quick Start 模式模式确定步骤之CyclingSample & Assay Technologies- 16 -运行设置运行设置 - Quick Start 模式模式确定步骤之Cycling关于 AcquiringSample & Assay Technologies- 17 -运行设置运行设置 - Quick Start 模式模式确定步骤之Cycling关于 AcquiringSample & Assay Technologies- 18 -运行设置运行设置 - Quick Start 模式模式确定步骤之Melt选做Sample & Assay Technologies-

7、19 -运行设置运行设置 - Advanced 模式模式选择模板Sample & Assay Technologies- 20 -运行设置运行设置 - Advanced 模式模式选择转子Sample & Assay Technologies- 21 -运行设置运行设置 - Advanced 模式模式输入信息Sample & Assay Technologies- 22 -运行设置运行设置 - Advanced 模式模式步骤和检测设置Sample & Assay Technologies- 23 -运行设置运行设置 - Advanced 模式模式步骤和检测设置之确定步骤与Quick Start模

8、式的确定步骤同Sample & Assay Technologies- 24 -运行设置运行设置 - Advanced 模式模式步骤和检测设置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 25 -运行设置运行设置 - Advanced 模式模式步骤和检测设置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 26 -运行设置运行设置 - Advanced 模式模式Channel 设置需要的数据收集通道，如果设置了多个通道，确定后有后续的相应通道的对话框弹出。Tube Position 保证所选的位置是能够

9、反应并发荧光的(一般是标准品)。Target Sample Range 与所用的检测化合物有关：嵌入式染料嵌入式染料(Intercalating dyes )应设置为1-3Fl单位；探针染料探针染料(Probes)一般一般应设置为 5-10Fl 单位；Quenched FRET 检测 应设置为70-80 Fl 单位，因为随着反应进行其荧光值将降低 。Acceptable Gain Range 应为默认的 -10 to +10步骤和检测设置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 27 -运行设置运行设置 - Advanced 模式模式步骤和检

10、测设置之Gain OptimisationSample & Assay Technologies- 28 -运行设置运行设置 - Advanced 模式模式设置完成Sample & Assay Technologies- 29 -关于Long range:在到达设置的循环数后，每一循环该步骤（一般设置变性阶段）都增加增加1秒秒。关于Touchdown: 在到达设置的循环数后，每一循环的该步骤（一般设置退火阶段）都降低降低1。Melt: 从一个较低温度升到一个较高温度，溶剂的特性，与核酸的特有属性。HRM:High Resolution Melt，高分辨率的熔解曲线，只有在装了HRM硬件的仪器上

11、才能运用。运行设置运行设置 - 额外设置额外设置 1Sample & Assay Technologies- 30 -关于Optical Denaturation Cycling: 用荧光强度来判断变性是否完成运行设置运行设置 - 额外设置额外设置 2Sample & Assay Technologies- 31 -运行设置补充说明运行设置补充说明- Data Acquisition设置运行程序时要设置数据采集点数据采集点可以在任何的一个步骤的终结时，并以蓝色的点作标记。可以通过点击“Acquiring”作数据收集的设置。从列表中选择需要的数据收集通道，可以选择多通道。点击“Dye Chart

12、”可观测数据收集通道的信息，包括激发光和发射光波长，可以应用的染料或显色剂。在程序的任何或所有步骤都能设数据收集点。Sample & Assay Technologies- 32 -当数据曲线饱和，会在纵坐标100处形成横线。 设置和调整设置和调整Gain 值值 1设置Gain值，让所有收集到的数据都在检测器(PMT)能检测的范围内 如果Gain值：- 过低 信号会因埋没在在本底噪声内而漏掉； - 过高 信号会超出范围 (饱和). 如果熔解曲线中，开始的一段时间纵坐标100处形成横线，熔解曲线应用较低的Gain设置来收集数据，但无需再重复做扩增反应。Sample & Assay Technol

13、ogies- 33 -实际数据的不会因Gain值设置而改变，Gain值设置改变了也能反映实际的数据变化趋势。每个数据采集通道的Gain值范围是 -10 10：-10为最低的敏感度；+10 最高敏感度。 0481026-2-4-6-8-1024816326412825651210242048Gain值设置每增加1，对PMT的输入电压约能增加2倍，这样对荧光检测的敏感度能增加2倍。Gain值的设置不可能每次都适用，最好能在hold阶段根据实验的奔底而做出改变。使用 Auto-Gain设置能自动检测反应初始时的荧光强度，设定出合适的Gain值。当使用Auto-Gain 设置时，在运行初始会出现该界面

14、。设置和调整设置和调整Gain 值值 2Sample & Assay Technologies- 34 -编辑样品编辑样品1. 命名样品2. 选择样品的 “Type”： Unknown None NTC Standard Positive control Negative control Calibrator4. Groups 用作统计分析5. Given Conc. 只有type是”Standard”时可编辑，用于制作标准曲线。3.是否选择 Selected6. Color用于颜色区分图表中不同的样品。Sample & Assay Technologies- 35 -综述: Absolute

15、 Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assaysSA BustinJ. Mol. Endo 2000 25,169-193标准曲线通过已知浓度的cDNA/RNA建立 关键因素:- DNA/RNA 片段要纯，单一片段- 移液准确- 标准样品稀释准确，平行性好绝对定量Sample & Assay Technologies- 36 -绝对定量标准曲线由5个或以上已知浓度样品而确定。一般每个浓度的样品做3个重复。如果每个梯度相差10倍，最理想的状态是， PCR的效

16、率足够高到达2，预期Ct值能相差3.162。3.162是10的平方根 。未知浓度的目标样品，其浓度和荧光值的变化规律与标准曲线一致。Sample & Assay Technologies- 37 -5,00050,000500,0005,000,00050,000,000500,000,000CTamount1. 曲线上的Ct与浓度的log关系2. 标准曲线 3.根据标准曲线计算反应效率反应效率与斜率(m)相关E= 10(-1/m) 1E=1=100%.4.判定系数 (R2)表示假设值与真实值的相关性， 越接近1相关性越好。绝对定量与反应效率Sample & Assay Technologie

17、s- 38 -绝对定量Sample & Assay Technologies- 39 -绝对定量Absolute QuantitationSample & Assay Technologies- 40 -绝对定量Sample & Assay Technologies- 41 -绝对定量的准确性完全决定于标准样品的准确性绝对定量Sample & Assay Technologies- 42 -参考文献: Absolute Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction a

18、ssaysSA BustinJ. Mol. Endo 2000 25,169-193标准曲线由已知浓度的cDNA/RNA构建关键因素:- DNA/RNA 一定是纯的，只有一种片段的- 移液准确- 稀释准确平行性好- 未知浓度的样品的点能落在标准曲线上绝对定量Sample & Assay Technologies- 43 -相对定量Analysis Quantitation Cycling A Green Show OK Threshold 手动调阈值，得出 Ct值Sample & Assay Technologies- 44 -熔解的特性是不同核酸的固有特性一般是用嵌入式染料分析PCR产物，加

19、热熔解从双链到单链不同的片段（如碱基序列不同，GC含量不同）有不同的熔解特性HRM十分敏感 ，能够区分一个碱基改变而引起的差别 (e.g. SNPs)HRM 比较熔解曲线的型状和温度来区分不同样品的特性HRM原理双链产物双链产物单链产物单链产物Sample & Assay Technologies- 45 -HRM 试剂嵌入式染料的荧光随着双链的解开而降低，其荧光强度与解链的特性相关高精度的温度控制和 光学数据收集，能得到十分详细和分辨率高的数据。Sample & Assay Technologies- 46 -HRM工作流程工作流程扩增设置正常的PCR步骤和HRM步骤，用嵌入式染料 (e.g SYTO 9)每个基因型都应设置Control(eg.已确定的wild-type, heterozygote, variant样品) 检测扩增曲线和扩增效率(扩增不好，HRM的结果也不好)HRM 分析运行HRM 分析指定controls1. 观测结