第3章基因操作的基本技术

1、第第3 3章章 基因操作的基本技术基因操作的基本技术主要内容主要内容1.1.凝胶电泳凝胶电泳2.2.核酸印记核酸印记3.PCR3.PCR1. 1. 凝胶电泳凝胶电泳1.1 1.1 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳原理：原理： 不同大小、不同形状和不同构象的不同大小、不同形状和不同构象的DNADNA分子在相同的电分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNADNA可与荧光染可与荧光染料溴化乙锭（料溴化乙锭（EBEB）结合，在紫外灯下可看到荧

2、光条带，籍此可）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。分析实验结果。核酸的分离与检测技术核酸的分离与检测技术一般过程：一般过程：u配胶配胶(缓冲液缓冲液+琼脂糖）琼脂糖）u制胶制胶(加入加入EB，0.5g/ml ）u梳子的选择梳子的选择u上样（上样（loading buffer)uMarker 的作用的作用u运动方向运动方向u电泳电泳u分析（低至分析（低至 5ng )u质粒质粒DNADNA通常具有三种不同的构象：通常具有三种不同的构象：共价闭合环状、线型、开环型。共价闭合环状、线型、开环型。u电泳时，一般共价闭合环状的迁移电泳时，一般共价闭合环状的迁移速度最快，其次为线状分子，开

3、环速度最快，其次为线状分子，开环型分子最慢型分子最慢凝胶成像系统凝胶成像系统（1）缓冲液的作用及种类）缓冲液的作用及种类u维持正负极维持正负极pH稳定：电泳时正负极发生电解反应，正极是氧稳定：电泳时正负极发生电解反应，正极是氧化反应（化反应（4OH-4e-=2H2O+O2)，负极是还原反应（，负极是还原反应（4H+4e-=2H2)，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱；，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱；u使溶液具有一定的导电性，以利于使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移；分子的迁移；u电泳缓冲液的电泳缓冲液的EDTA螯合螯合Mg2+ 等离子，失活等离子，失活DNA酶，还可酶，还可防

4、止防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。离子与核酸生成沉淀。nTAETAE：超螺旋超螺旋DNADNA电泳时更符合实际分子质量（电泳时更符合实际分子质量（TBETBE中大于实际分子质量），中大于实际分子质量），且双链线状且双链线状DNADNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%10%，分离大于，分离大于13kb13kb片段效果更好；回收片段效果更好；回收DNADNA片段时也选用片段时也选用TAETAE；但缓冲容量小，不宜长；但缓冲容量小，不宜长时间电泳。时间电泳。nTBE:TBE:缓冲能力强，适于长时间电泳；分离小于缓冲能力强，适于长时间电泳；分离小于1kb1kb

5、的片段时效果更好；用的片段时效果更好；用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并与琼脂糖相互作用生成非共价结于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使合的四羟基硼酸盐复合物而使DNADNA片段的回收率降低，不宜在回收电泳中片段的回收率降低，不宜在回收电泳中使用。使用。nTPETPE：缓冲能力较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不缓冲能力较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收宜在回收DNADNA片段的电泳中使用。片段的电泳中使用。 （Tris三羟甲基氨基甲烷/Acetate/EDTA） （Tris/Borate/EDTA）

6、（Tris/Phosphrate/EDTA） （2 2）影响）影响DANDAN片段琼脂糖电泳的因素：片段琼脂糖电泳的因素：lDNADNA分子的大小：线性分子的大小：线性DNADNA的迁移率与其分子量的对数值成的迁移率与其分子量的对数值成反比。反比。l琼脂糖浓度：分离大小不同的琼脂糖浓度：分离大小不同的DNADNA片段需要选择合适的琼脂片段需要选择合适的琼脂糖凝胶浓度。糖凝胶浓度。lDNADNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNADNA分子迁移率比线性分子迁移率比线性DNADNA分子快，线性分子快，线性DNADNA分子比开环分子比开环DN

7、ADNA分子分子快。快。l电流强度：每厘米凝胶电压不超过电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V5V，若电压过高分辨率，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性会降低，只有在低电压时，线性DNADNA分子的电泳迁移率与所分子的电泳迁移率与所用电压成正比用电压成正比。500bp500bp以下：聚丙烯酰胺凝胶电泳以下：聚丙烯酰胺凝胶电泳20Kb20Kb以上：脉冲电场凝胶电泳以上：脉冲电场凝胶电泳（3 3）脉冲电场凝胶电泳）脉冲电场凝胶电泳 在单一电场琼脂糖凝胶中，在单一电场琼脂糖凝胶中，DNADNA分子的有效直径超过凝胶分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使孔径时，在电场作用下，迫使DNA

8、DNA变形变形挤过筛孔，而沿着泳动挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响程度较小。而在成一定方向伸直，因而分子大小对迁移率影响程度较小。而在成一定角度的双电场中，电场方向的改变会使角度的双电场中，电场方向的改变会使DNADNA分子重新变形后才分子重新变形后才能在新方向上通过凝胶筛孔，能在新方向上通过凝胶筛孔，DNADNA分子的分子的变形与改向变形与改向与其分子与其分子大小相关程度更高，在交替变换电场方向、电场强度的条件下大小相关程度更高，在交替变换电场方向、电场强度的条件下可以分离大分子量可以分离大分子量DNADNA分子（分子（10M).10M).1.2 1.2 聚丙烯酰胺凝胶

9、电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)u由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在酰胺在催化作用催化作用下形成的三维网状结下形成的三维网状结构凝胶，网状结构具有分子筛效应，构凝胶，网状结构具有分子筛效应，可以分离大小不同的可以分离大小不同的DNADNA分子分子 。u分辨率高，仅差分辨率高，仅差1bp1bp的的DNADNA分子也能清分子也能清晰地分开（孔径比琼脂糖凝胶小）。晰地分开（孔径比琼脂糖凝胶小）。u可用于分离单链核酸分子：如可用于分离单链核酸分子：如RNARNA、引、引物等物等u装载的样品量大，回收的装载的样品量大，回收的DNADNA纯度高纯度高 聚合

10、过程需要有自由基催化完成聚合过程需要有自由基催化完成, , 过硫酸铵（过硫酸铵（APAP）为催化剂，四甲基乙二胺）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）为加速剂）为加速剂 主要内容主要内容1.1.凝胶电泳凝胶电泳2.2.核酸印记核酸印记3.PCR3.PCR2. 核酸印迹核酸印迹 2.1 Southern Blotting原理：原理： 待测的待测的DNADNA分子分子切割切割后，通过凝胶电泳进行后，通过凝胶电泳进行分离分离，继而，继而将其将其变性变性，并按其在凝胶中的位置，并按其在凝胶中的位置转移转移到硝酸纤维素薄膜或到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，尼龙膜上，固定固定后再与同位素或其它标记物

11、标记的后再与同位素或其它标记物标记的DNADNA或或RNARNA探针进行探针进行杂交杂交反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤洗涤后用自后用自显影显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。其相对大小。 用途：用途：n 检测样品中是否含有目的检测样品中是否含有目的DNADNAn 了解目的了解目的DNADNA的大小、方便基因的获取的大小、方便基因的获取n 检测基因拷贝数检测基因拷贝数 1975年，英国

12、爱丁堡大学的年，英国爱丁堡大学的Southern EM首创了首创了DNA分子杂交分子杂交方法，称之为方法，称之为Southern印迹转移印迹转移 实验流程：实验流程：Southern BlottingSouthern Blotting应用举例：基因及其旁侧序列的酶切位点检测应用举例：基因及其旁侧序列的酶切位点检测 3kb2kb1kb1kbEEEE2.2 Northern Blotting 原理：在变性条件下将待检的原理：在变性条件下将待检的RNARNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同继而按照同Southern BlottingSouthern Blotting相同的原

13、理进行转膜和用探针相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNAmRNA）及其含）及其含量。量。 与与SouthernSouthern杂交的不同杂交的不同 靶核酸：靶核酸：RNARNA SouthernSouthern是先电泳后变性，而是先电泳后变性，而NorthernNorthern是电泳前变性；是电泳前变性； SouthernSouthern是碱变性，而是碱变性，而NorthernNorthern采用甲醛、乙二醛、二甲采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性，因为采用碱变性会导致基亚砜等变性，因为采

14、用碱变性会导致RNARNA水解水解 1977年年, Stark GR建立了建立了RNA分子杂交技术，被称为分子杂交技术，被称为Northern印迹转移印迹转移 2.3 Western Blotting 原理：在变性条件下将待检的蛋白质样品进行原理：在变性条件下将待检的蛋白质样品进行SDS-PAGESDS-PAGE凝凝胶电泳，继而按照同胶电泳，继而按照同Southern BlottingSouthern Blotting相同的原理进行相同的原理进行转膜，然后利用探针进行检测。对已知表达蛋白，可用相转膜，然后利用探针进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为探针（一抗）进行检测，对新基因的表达产物

15、，应抗体作为探针（一抗）进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体进行检测。可通过融合部分的抗体进行检测。 用途：检测复杂生物样品中蛋白质的表达水平或含量。用途：检测复杂生物样品中蛋白质的表达水平或含量。 样品变性处理样品变性处理：uSDSSDS：破坏氢键、结合蛋白：破坏氢键、结合蛋白u-巯基乙醇：破坏二硫键巯基乙醇：破坏二硫键u高温处理：使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构，同时高温处理：使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构，同时使整个蛋白充分结合使整个蛋白充分结合SDSSDS，带上负电荷。，带上负电荷。 SDS-PAGESDS-PAGE凝胶电泳凝胶电泳u浓缩胶：浓缩胶：pH6.

16、8, pH6.8, 浓度浓度3 3，交联度低、孔径大、利于所有交联度低、孔径大、利于所有蛋白质在分离胶前集中成一条蛋白质在分离胶前集中成一条很细的区带很细的区带u分离胶：分离胶： pH8.8pH8.8按照分子量按照分子量大小分开蛋白质大小分开蛋白质分离胶的选择分离胶的选择SDS-PAGESDS-PAGE垂直电泳系统垂直电泳系统印迹印迹u固相材料：固相材料：NC NC 膜、膜、DBMDBM、DDTDDT、尼龙膜、尼龙膜、PVDF PVDF （聚偏二氟（聚偏二氟乙烯）乙烯） 等。等。PVDFPVDF具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性有更好的化

17、学兼容性u方法：毛细管印迹法方法：毛细管印迹法( (效率较低，仅转移效率较低，仅转移10102020蛋白，较蛋白，较慢）和电泳印迹法（快速高效）慢）和电泳印迹法（快速高效）封闭封闭 用用BSABSA或脱脂奶等将膜上未结合蛋白质的位点封闭，以免或脱脂奶等将膜上未结合蛋白质的位点封闭，以免这些位点和后续实验中的抗体结合而干扰分析这些位点和后续实验中的抗体结合而干扰分析。探针杂交探针杂交u用待测蛋白质的抗血清（一抗）处理膜上的印迹，印迹中只用待测蛋白质的抗血清（一抗）处理膜上的印迹，印迹中只有待测蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。有待测蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。u清洗去除

18、未结合的一抗后，进一步用适当标记的二抗处理，清洗去除未结合的一抗后，进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，带有标记的二抗与一抗结合，可以指二抗是指一抗的抗体，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即待测蛋白质的条带位置。示一抗的位置，即待测蛋白质的条带位置。u除了使用抗体或蛋白作为检测探针外，也可用其它探针如放除了使用抗体或蛋白作为检测探针外，也可用其它探针如放射性标记的射性标记的DNADNA，可以检测印迹中的，可以检测印迹中的DNA DNA 结合蛋白。结合蛋白。n 二抗标记方法二抗标记方法u 酶联（标）法：如碱性磷酸酶或辣根过氧化物标记的二酶联（标）法：如碱性磷酸酶或辣根过

19、氧化物标记的二 抗，抗， 这些酶可以催化某种显色反应。这些酶可以催化某种显色反应。u 荧光素标记法：主要有异硫氰酸荧光素荧光素标记法：主要有异硫氰酸荧光素(FITC)(FITC)或罗达明或罗达明 (Lissamine rhodamine B200)(Lissamine rhodamine B200)。u 同位素标记法：同位素标记法：125I Iu 高密度金属标记：金标记高密度金属标记：金标记u二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，

20、大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。度。 一抗一抗二抗二抗斑点杂交（斑点杂交（DotDot blotblot）u将核酸样品变性后直接点样于滤膜上，烤干或紫外线照射以将核酸样品变性后直接点样于滤膜上，烤干或紫外线照射以固定标本，然后与探针进行杂交的方法称斑点杂交或狭缝杂固定标本，然后与探针进行杂交的方法称斑点杂交或狭缝杂交。斑点印迹为斑点状，狭缝印迹为线状。交。斑点印迹为斑点状，狭缝印迹为线状。u斑点杂交耗时短，可做半定量分析，一

21、张膜上可同时检测多斑点杂交耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。多用于病原体基因，如微生物的基因，但也可用于个样品。多用于病原体基因，如微生物的基因，但也可用于检查人类基因组中的检查人类基因组中的DNADNA序列。序列。原位杂交（原位杂交（inin situsitu hybridizationhybridization）u将噬菌斑或菌落从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将噬菌斑或菌落从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出将滤膜上的菌落裂菌以释出DNADNA。将。将DNADNA烘干固定于膜上与烘干固定于膜上与32P32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落

22、杂交信号，并与标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。平板上的菌落对位。u可以用于筛选大量标本，因为它使细胞或噬菌体直接在膜上可以用于筛选大量标本，因为它使细胞或噬菌体直接在膜上溶解，所以溶解，所以DNADNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为为DNADNA纯度不够，会产生高本底。纯度不够，会产生高本底。 2.4 2.4 其他印迹杂交技术其他印迹杂交技术原位杂交筛选原位杂交筛选对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接对应的

23、菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落找出阳性菌落,多多用于从基因文库中筛选目标基因。用于从基因文库中筛选目标基因。组织原位杂交筛选组织原位杂交筛选 细胞或组织经处理后不裂解，而是通透性增加使探针进细胞或组织经处理后不裂解，而是通透性增加使探针进入细胞或组织内部，确定目的核酸分子在细胞内的位置入细胞或组织内部，确定目的核酸分子在细胞内的位置主要内容主要内容1.1.凝胶电泳凝胶电泳 琼脂糖，琼脂糖，PAGEPAGE，脉冲场，脉冲场2.2.核酸印记核酸印记 Southern, Northern,Western BlottingSouthern, Northern,Western Blottin

24、g 原位杂交原位杂交3.PCR3.PCR3. PCR (Polymerase Chain Reaction)3.1 基本原理基本原理PCRPCR由变性由变性-退火退火-延伸三个延伸三个基本反应步骤构成：基本反应步骤构成：u模板模板DNADNA的变性：模板的变性：模板DNADNA经经加热至加热至9494左右一定时间后，左右一定时间后，使模板使模板DNADNA双链解链成单链，双链解链成单链，以便它与引物互补结合，为下以便它与引物互补结合，为下轮反应作准备；轮反应作准备；u模板模板DNADNA与引物的退火：模板与引物的退火：模板DNADNA变性后，温度降至变性后，温度降至5555左左右，引物与模板右

25、，引物与模板DNADNA单链的互单链的互补序列配对结合；补序列配对结合；变性变性退火退火延伸延伸u引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引引物结合物在物结合物在DNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，以下，以dNTPdNTP为反应原料，靶为反应原料，靶序列为模板，按碱基配合成序列为模板，按碱基配合成一条新的与模板一条新的与模板DNA DNA 链互补链互补的半保留复制链。的半保留复制链。u重复循环变性重复循环变性-退火退火-延伸延伸三过程，就可获得更多的三过程，就可获得更多的“半保留复制链半保留复制链”，而且这，而且这种新链又可成为下次循环的种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需

26、模板。每完成一个循环需 2 24 4分钟，分钟，2 23 3小时就能将小时就能将待扩目的基因扩增放大几百待扩目的基因扩增放大几百万倍。万倍。3.2 反应体系反应体系反应体系包括引物、模板、反应体系包括引物、模板、dNTP、DNA聚合酶、缓冲液聚合酶、缓冲液引物引物：和模板配对的序列一般长：和模板配对的序列一般长20bp左右，在引物的左右，在引物的5端可加端可加上上RBS、启动子、或限制性内切酶识别序列。而、启动子、或限制性内切酶识别序列。而3端必须严格端必须严格配对。浓度一般为配对。浓度一般为0.5 M，浓度过高会导致非特异性扩征。，浓度过高会导致非特异性扩征。模板模板：模板可以是：模板可以是

27、DNA片段、质粒、染色体，甚至可以直接在片段、质粒、染色体，甚至可以直接在反应体系中加入细胞来提供模板。粗制的模板加入量不宜过多，反应体系中加入细胞来提供模板。粗制的模板加入量不宜过多，以避免杂质（核酸酶、蛋白酶等）对反应的抑制作用。以避免杂质（核酸酶、蛋白酶等）对反应的抑制作用。dNTP：一般加入量为：一般加入量为200 M，过高浓度会提高错配几率。，过高浓度会提高错配几率。DNA聚合酶聚合酶：根据不同酶产品，按推荐量添加。：根据不同酶产品，按推荐量添加。缓冲液：缓冲液：主要成分为主要成分为50mM KCl，10mM Tris-HCl和和1.5 Mm MgCl2 Taq DNA聚合酶的浓度：

28、聚合酶的浓度： 1.02.5 U/100 l反应液反应液dNTP的浓度：的浓度： 20200 mol/L。Mg2+浓度：浓度： 0.52.5 mmol/L。引物的浓度：引物的浓度： 0.10.5 mol/L 3.3 PCR引物的设计原则引物的设计原则 u 引物应用核酸序列保守区内设计并具引物应用核酸序列保守区内设计并具有特异性有特异性引物与非特异性扩增序列的同源性不应超过引物与非特异性扩增序列的同源性不应超过70%，避免有连续避免有连续8个以上碱基同源个以上碱基同源。 u 产物不能形成二级结构。产物不能形成二级结构。u 引物长度一般在引物长度一般在1530碱基之间。碱基之间。u G+C含量在含

29、量在40%60%之间。之间。u 碱基要随机分布。碱基要随机分布。u 引物自身、引物之间不能有连续引物自身、引物之间不能有连续4个个以上碱基的互补以上碱基的互补u 引物引物5端可以修饰。端可以修饰。u 引物引物3端不可修饰，也不能形成任何端不可修饰，也不能形成任何二级结构。二级结构。u 简并引物：简并引物：3端要避开密码子的第端要避开密码子的第3位。位。53产物（1） 反转录反转录PCR (ReverseTranscription PCR)u 经过反转录酶的作用把经过反转录酶的作用把RNARNA反转录成反转录成cDNAcDNA后再通过后再通过PCRPCR扩增。扩增。u 应用于应用于RNARNA的

30、构造解析、的构造解析、cDNAcDNA的克隆及的克隆及RNARNA水平上的表达解析水平上的表达解析等多种领域。等多种领域。 3.4 主要的主要的PCR应用技术应用技术 一步法一步法RT-PCR(2) 重叠延伸重叠延伸PCR SOEPCR(gene splicing by overlap extension 重叠延伸重叠延伸PCRPCR 技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板互相搭桥、互为模板, ,通过多次通过多次PCRPCR扩增扩增, ,从而获得目的从而获得目的DNA DNA 基因片段的方法基因片段的方法. .u 相连引物间的重叠区域

31、以相连引物间的重叠区域以151520 20 个碱基为宜个碱基为宜u不需要内切酶消化和连接酶处理，不需要内切酶消化和连接酶处理，操作非常简便操作非常简便u 可用于体外进行可用于体外进行定点突变定点突变或或DNADNA片段连接片段连接, , 可用于大片段可用于大片段基因的人工合成基因的人工合成, , 也可在两片段间也可在两片段间插入短序列插入短序列。u 成功率高成功率高. .省去了常规亚克隆的烦琐工作省去了常规亚克隆的烦琐工作. .重叠延伸重叠延伸PCRPCR原理原理A1 A2 B1 B2 33555533A1 B2 A1 B2 (3)(3)反向反向PCRPCR反向反向PCRPCR是用于扩增、克隆

32、已知是用于扩增、克隆已知DNADNA区段上下游旁侧区段的区段上下游旁侧区段的PCRPCR方法，可以用于确定未知的旁侧方法，可以用于确定未知的旁侧DNADNA序列。序列。原理图：原理图：如果已知序列为转座子，可以高通量的进行基因型如果已知序列为转座子，可以高通量的进行基因型- -表型关系的鉴定和研究表型关系的鉴定和研究（4）多重）多重PCR 多重多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物，又称多重引物PCR或复合或复合PCR，它是在同一它是在同一PCR反应体系里加上二对以上反应体系里加上二对以上引物引物，同时扩增出，同时扩增出多个核酸片段的多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试

33、剂和操作过反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般程与一般PCR相同相同多重多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定, 或者或者病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。 在同一在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行进行PCR扩增扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染病原体感染 在疾病诊断方面可以节省大量时间和病人在疾病诊断方面可以节省大量时间和病人DNA样品样品（5）不对称）不

34、对称PCR（asymmetric PCR）不对称不对称PCRPCR：用不等量的引物对扩增产生大量单链：用不等量的引物对扩增产生大量单链DNADNA的的PCRPCR方法方法, ,用于用于DNADNA测序测序和和探针制备探针制备 两条引物的比例两条引物的比例50:1100:1， 先产生双链先产生双链DNA，量少的引物耗完后开始产，量少的引物耗完后开始产生单链生单链DNA，PCR结束后通过电泳分离单、双链结束后通过电泳分离单、双链DNA，回收单链，回收单链DNA（6）嵌套）嵌套PCR（nested primer PCR）嵌套嵌套PCR：是指用两对引物扩增是指用两对引物扩增一个目标片段的一个目标片段的

35、PCR，第一对引，第一对引物序列在第二对引物序列的外侧物序列在第二对引物序列的外侧（外引物和内引物）。（外引物和内引物）。如果内侧引物的特异性比较差，如果内侧引物的特异性比较差，使用该引物不能使靶序列得到有使用该引物不能使靶序列得到有效扩增。这时可以先用特异性好效扩增。这时可以先用特异性好的外侧引物进行的外侧引物进行PCR，然后将其，然后将其扩增产物作为模板，用内侧引物扩增产物作为模板，用内侧引物进行第二次进行第二次PCR。反之，如果外侧引物特异性较差，反之，如果外侧引物特异性较差，通过内侧引物再次通过内侧引物再次PCR也能提高也能提高特异性（两对引物均可扩增同一特异性（两对引物均可扩增同一条

36、非特异性条带的可能性很小）条非特异性条带的可能性很小）半嵌套半嵌套PCR：三条引物，其中一：三条引物，其中一条同时充当外引物和内引物。条同时充当外引物和内引物。（7）热启动）热启动PCR（hot start PCR）热启动热启动PCR: 温度温度 超过超过70才能进行才能进行DNA聚合反应的聚合反应的PCR。一般一般Taq DNA聚合酶在低温条件下也有活性，如果引物特异性差，当聚合酶在低温条件下也有活性，如果引物特异性差，当PCR反应体系配置完成之后，如果模板中有部分单链，有可能部分引物反应体系配置完成之后，如果模板中有部分单链，有可能部分引物在错误位点结合进行非特异性扩增。在错误位点结合进行

37、非特异性扩增。l 模板预热法（模板预热法（70 后加入引物和酶等物质）后加入引物和酶等物质）l 蜡防护层法蜡防护层法l 改进的耐热改进的耐热DNA聚合酶（聚合酶（94 高温处理后才具有活性）高温处理后才具有活性）（8）免疫）免疫PCR（immuno PCR）免疫免疫PCR：是是1992年年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。该建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起来，利用抗原抗体反应的特异性和来，利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的扩增

38、反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。其本质是一种以一种微量抗原检测技术。其本质是一种以PCR扩增一段扩增一段DNA报告分子报告分子代代替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型ELISA。 抗原抗原亲和素亲和素标记的抗体标记的抗体+DNA报告分子报告分子生物素生物素PCR 检测检测酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay） 降落降落PCR ：是一种设计多循环以使相连循环的退火温度越来越低：是一种设计多循环以使相连循环的退火温度越来越低,从而达从而达到最佳扩增条件的到最佳扩增条件的PCR方法。方法。 反

39、应过程中起始退火温度高于反应过程中起始退火温度高于Tm 值值,随着循环的进行随着循环的进行,退火温度逐渐降退火温度逐渐降低到低到Tm 值值,从而确保第一个引物从而确保第一个引物- 模板杂交事件发生在最互补的反应物之模板杂交事件发生在最互补的反应物之间间,退火温度最终低于退火温度最终低于Tm 值。值。 退火温度的范围可跨越退火温度的范围可跨越15 ,从高于从高于Tm 5 至低于至低于Tm 10 左右左右,条件允条件允许的话许的话,退火温度可以退火温度可以1 2 递降。尽管退火温度最终会降低到非特异递降。尽管退火温度最终会降低到非特异性杂交的性杂交的Tm 值值,但此时目的扩增产物已开始几何扩增但此

40、时目的扩增产物已开始几何扩增,在剩余循环中将超过在剩余循环中将超过任何非特异性产物的扩增量。任何非特异性产物的扩增量。 降落降落PCR 是一种潜在的一步法找到最佳退火温度的方法是一种潜在的一步法找到最佳退火温度的方法,大大提高了工大大提高了工作效率，保证特异性条带被优先扩增出来。作效率，保证特异性条带被优先扩增出来。 （9）降落）降落PCR（touch down PCR）(10) (10) 实时定量实时定量PCR(RealPCR(Real time PCR) time PCR)原理原理u通过对通过对 PCR PCR 扩增反应中每一个循环产物扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实荧光信号的实时检测

41、时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。从而实现对起始模板定量及定性的分析。u在实时荧光定量在实时荧光定量 PCR PCR 反应中，引入了一种荧光化学物反应中，引入了一种荧光化学物质，随着质，随着 PCR PCR 反应的进行，反应的进行， PCR PCR 反应产物不断累计，反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 定量点的选择定量点的选择

42、终点定量误差大终点定量误差大起点定量信号过低，易受背景信起点定量信号过低，易受背景信号干扰号干扰9696个相同样品的扩增个相同样品的扩增基线期基线期平台期平台期 基线代表背景信号，一般前基线代表背景信号，一般前3 31515循环所产生的信号循环所产生的信号被背景掩盖，这些循环的荧光信号可用基线信号表示。被背景掩盖，这些循环的荧光信号可用基线信号表示。 一般选定基线信号标准偏差的一般选定基线信号标准偏差的1010倍作为荧光信号的阈倍作为荧光信号的阈值，荧光信号到达阈值时的循环数为值，荧光信号到达阈值时的循环数为C CT T值，该值和初值，该值和初始始DNADNA模板数目的对数成反比。模板数目的对数成反比。CTR RB B: :背景荧光信号背景荧光信号R RS S: :单位分子荧光信号单位分子荧光信号通过通过CT-lgX0标准曲线可标准曲线可以实现模板的绝对定量以实现模板的绝对定量eeCT荧光标记原理荧光标记原理u 非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：SYBR Green SYBR Gree