第三讲2 常用分子克隆工具酶简介

1、常用工具酶简介常用工具酶简介 第一节第一节DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase(DNA ligase) ) 2 DNA ligase简介简介2.1 T4 DNA ligase 连接连接类型：类型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA的黏性末端和平末端的黏性末端和平末端 2.2 大肠杆菌大肠杆菌 DNA ligase dsDNA的黏性末端和平末端的黏性末端和平末端 1 DNA polymerasepolymerase分类分类依赖于DNA的DNA聚合酶: Ecoli DNA polymerase I klenow片段 T4 phage DNA ploymerase

2、 T7 phage DNA ploymerase 耐热DNA聚合酶(Taq 酶)依赖于RNA的DNA聚合酶: 反转录酶(reverse transcriptase) 1.1 Ecoli DNA polymerase I 分类：分类： DNA pol I DNA pol DNA pol DNA pol I Mn2+存在时存在时 Mg2+存在时存在时 DNase I作用特点作用特点DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI与与Pol I 的的切口移位切口移位Pol I1.2 Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶I I的枯草杆菌蛋白酶水解产物。活性：5 3聚合酶 3 5外切酶用途： 3-

3、末端补平 3-末端抹平 cDNA第二链合成 双脱氧系统测序3-末端补齐 3-末端标记5-ACGTTGCAAACTG-3 3-TGCAACGTTTGAC.5 cDNA第二链合成 mRNA 3-UGCAACGUUUGAC.5 c DNA 5-ACGTTGCAAACTG GAC5353555555333333555-5 1.3 T4 DNA polymerase 特点：特点： 53聚合酶活性聚合酶活性 35外切酶活性外切酶活性 外切酶活性外切酶活性 聚合酶活性聚合酶活性 无无dNTP dNTP1.4 Taq DNA polymerase 特点：特点： 分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子

4、量为94,000，最适反应，最适反应温度温度75-80 。 5-3聚合酶活性聚合酶活性 5-3外切酶活性外切酶活性 用途：用途： 主要用于主要用于DNA的体外扩增的体外扩增 Taq Pol 和和PCR 5 3 变性变性 3 5 5 3 引物引物 3 5 复性复性 5 3 5 3 3 5 引物引物 3 5 5 3 延伸延伸 5 3 3 5 3 5 1.5 反转录酶反转录酶(reverse transcripase) 用途：用途： cDNA第一链的合成第一链的合成 补平反应补平反应 用于用于DNA测序测序 1.1 末端转移酶末端转移酶（TdT） 反应特点反应特点 在酶的催化下将在酶的催化下将dNT

5、P加到加到DNA分子的分子的3OH末末端，催化作用不需要模板。端，催化作用不需要模板。 用途用途 3-加尾，便于两加尾，便于两DNA分子重组分子重组 3-末端标记末端标记 -32PATP ATP 5 P OH 3 5 32P OH 33HO P 5 3 HO 32P 5 -32PATP ATP 5 P OH 3 5 32P OH 33HO P 5 3 HO 32P 5 1.2 T4 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化反应：催化反应： 正向反应正向反应 催化催化5-OH末端的磷酸化末端的磷酸化 交换反应交换反应1.2 T4 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 用途：用途： 1) DNA或或RNA的的5

6、末端标记末端标记 2) 分子克隆过程中以获得分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端，磷酸基末端，便于连接酶反应便于连接酶反应1.3 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 用途用途 1) 载体载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率重组频率 2) 5端端 核酸末端标记核酸末端标记 I II 5 P OH3 5HO OH3 5 P OH 3 3HO P 5 3HO OH5 3HO P 5 碱性碱性磷酸酶与磷酸酶与T4 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶活性活性 1.1 S1核酸酶核酸酶 特点：特点： ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区双螺旋变性区 用途用途 1) 基因突变

7、基因突变-缺失，常与外切酶，如缺失，常与外切酶，如ExoIII、外切酶、外切酶、Bal31连用连用 2) DNA定序分析定序分析 3) S1作图法作图法 4) 基因结构分析基因结构分析 5) tRNA结构分析结构分析 ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)555555S1核酸酶活性核酸酶活性 1.3 DNase I 用途用途 1) 切口移位，制备切口移位，制备DNA探针探针 2) 制备制备RNA样品时除去样品时除去DNA分子分子 3) 基因突变时产生切口基因突变时产生切口 ds-DNA结构结构: 切口切口, 缺口缺口, 断口断口裂口裂口(gap) 缺口缺口(nick)

8、 断口断口(cut)3HO P53HO P5 Mn+存在时存在时 Mg+存在时存在时 DNaseI作用特点作用特点DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI与与Pol I 的的切口移位切口移位Pol I用途：用途： 在在DNA制备时用于降解制备时用于降解RNA分子分子 去除去除DNA:RNA 或或RNA:RNA中没有杂合中没有杂合的的 RNA区域区域 特异地降解特异地降解DNA:RNA杂合链中的杂合链中的RNA部分，产生不同长度的具有部分，产生不同长度的具有3OH和和5P端的端的寡核苷酸，它不能降解单链或双链的寡核苷酸，它不能降解单链或双链的DNA（或（或RNA). 5AAGCTT3

9、 HindIII 5A AGCTT3 3TTCGAA5 3TTCGA A5 S1 dNTP+ klenow frag 5A T3 5AAGCT AGCTT3 3T A5 3TTCGA TCGAA5 T4 DNA连接酶连接酶 T4 DNA连接酶连接酶 5AT3 5AAGCTAGCTT3 3TA5 3TTCGATCGAA5切平反应和补平反应切平反应和补平反应 四种不同补平反应四种不同补平反应5-GGATCC-3 BamHI 5-G GATCC-33-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG GAT