细胞因子电泳纯度非还原型SDSPAGE测定标准操作规程

1、.细胞因子电泳纯度非还原型SDSPAGE测定标准操作规程依据：中华人民XX国药典2005年版第三部。X围：适用于细胞因子纯度的检测。目的：检测细胞因子蛋白质纯度。原理：蛋白质具有不同的电荷和分子量，在经过阴离子去污剂SDS处理后，蛋白质分子上的电荷被中和，在聚丙稀酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量。由于不连续的PH梯度作用，样品被压缩成一条狭窄区带，采用染色液染色，经扫描仪扫描胶片可及时观察结果。内容：1 材料11样品：经二人复核批号无误后检测12试剂甲醇 CH3OH分析纯无水乙醇 CH3CH2OH分析纯浓盐酸 HCl分析纯甘油 C3H8O3

2、 分析纯硝酸银 AgNO3 分析纯重铬酸钾 K2Cr2O7分析纯正丁醇 C4H9OH 分析纯甲醛 HCHO分析纯丙烯酰胺 CH2CHCONH2 分析纯甲叉双丙烯酰胺（CH2CHCONH2）2CH2 分析纯过硫酸铵 （NH4）2S2O8 分析纯TEMED（四甲基乙二胺）(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2 分析纯甘氨酸 C2H5NO2 分析纯SDS（十二烷基硫酸钠）C12H25O4SNa 分析纯乙酸 CH3COOH 分析纯碳酸钠 Na2CO3 分析纯溴酚蓝 C19H10Br4O5S 分析纯13注射用水：符合中华人民XX国药典2005年版要求。14设备141扭力天平 XX第二天平仪器厂142垂

3、直板状电泳槽东方仪器厂143恒温恒流电泳仪法玛西亚公司144快速电泳槽BIORADUSA145全自动扫描仪CS-930日本岛津146TS-1型摇床15器皿：500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管3000ml三角瓶、平皿、1000ml烧杯、80ml烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理。2 方法21准备工作211工作环境：控制区，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。212调试仪器设备2121恒温恒流电泳仪工作状态良好，已经挂“备用”标志牌。2122全自动扫描仪工作状态良好，已挂“备用” 标志牌。2123扭力天平工作状态良好，已挂“备用” 标志牌。213摘下扭

4、力天平“备用” 标志牌，挂“运行中” 标志牌。214配液：以下溶液的配制完成后，均需经二人复核无误后，在瓶外贴标签，注明溶液的名称、浓度、体积、批号及配制日期。2141聚丙烯酰胺凝胶母液 100ml用扭力天平准确称取丙烯酰胺30g, 甲叉双丙烯酰胺0.8g，加50ml注射用水溶解后定容至100ml，过滤，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。一般不超过12个月。2142分离胶缓冲液 100ml用扭力天平准确称取Tris18.15g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调节pH8.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签

5、，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。2143浓缩胶缓冲液 100ml用扭力天平准确称取Tris6.05g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调pH6.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。2144 1%SDS 50ml 用扭力天平准确称取SDS 0.5g，溶于50ml注射用水中，溶解后，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存。2145 1% TEMED 50ml用吸管准确吸取TEMED0.5ml，溶于50ml注射用水中，二人复核，贴签，标明

6、溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。2146 1% 过硫酸铵 50ml 用扭力天平准确称取过硫酸铵0.5g，溶于50ml注射用水中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。2147电极缓冲液 3000ml 用扭力天平准确称取Tris9g、甘氨酸43.2g、SDS3g，溶于2000ml注射用水中，补加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。2148固定液 500ml 用量筒准确量取甲醇250ml，乙酸50ml，补加注射用水至500ml，置于500ml瓶中，二人复核，贴签

7、，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。2149洗液 3000ml 用量筒准确量取无水乙醇300ml，乙酸150ml，补加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。21410重铬酸钾溶液 200ml用扭力天平准确称取重铬酸钾10g，加注射用水至200ml；加浓HNO32ml摇匀溶解，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存。21411硝酸银溶液 200ml用扭力天平准确称取硝酸银0.4g，加注射用水至200ml，置于棕色瓶中，避光保存，二人复核，贴签，标明溶液

8、的名称、浓度、体积、批号、配制日期，限当次试验使用。21412显色液 3000ml 用扭力天平准确称取Na2CO318g，加注射用水至3000ml，溶解后，加0.6ml甲醛，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。21413终止液 500ml 用吸管准确吸取乙酸5ml，溶于500ml注射用水中，置于500ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。21414样品处理液（非还原型） 10ml用扭力天平准确称取Tris0.303g、SDS0.8g、溴酚蓝0.189g，溶于2ml注射用水中，加入甘油4ml，浓

9、HCl0.189ml，加注射用水定容至10ml，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。4贮存。215样品准备：将样品自冰箱内拿出，放置室温融化后，将样品与样品处理液按3：1（V/V）的比例混匀，沸水处理35分钟，待用。22操作过程2211分离胶（13.5%）制备聚丙烯酰胺胶母液14.4ml, 分离胶缓冲液8ml,1%SDS3.2ml，注射用水 3.2ml，1%过硫酸铵1.6ml，1%TEMED1.6ml，制成胶量32ml。2212浓缩胶(4.5%)的制备聚丙烯酰胺凝胶母液2.4ml, 浓缩胶缓冲液4ml, 注射用水4.8ml，1%SDS 1.6ml，1%过硫酸

10、铵1.6ml，1%TEMED1.6ml，pH6.8，成胶量16ml。2213灌胶灌胶时先将电泳槽阳极侧用透析纸包上，在电泳槽内加满水，靠水压封住阳极侧缝隙，以免胶溶液漏出；在两玻璃板间加分离胶，加胶完毕后，用注射器沿玻璃板在液面上覆盖一层（约0.3cm高）正丁醇；待胶凝固后，将电泳槽内注射用水及胶表面的正丁醇倒掉，并用滤纸吸干；向电泳槽内加入电极缓冲液、在浓缩胶位置插上梳子，在分离胶上加浓缩胶，待胶凝固后抽去梳子。222加样:将处理后样品按每孔不少于5ug的蛋白量，加入样品槽内.223电泳: 打开电泳仪，摘下“备用”标志牌，挂“运行”标志牌，调定电流，起始电流15mA，待指示线跑至分离胶处，改

11、电流为25 mA，电泳时间约为2.5小时，待指示剂至底线处，停止电泳,关闭电泳仪，摘下“运行”标志牌,挂“备用”标志牌。224染色电泳完毕后取下胶片，置于5倍胶体积的固定液内12h（或室温振荡30分钟）；洗液洗三次，每次10分钟，37摇床内振荡；取5ml重铬酸钾母液加入200ml注射用水中，将胶片置其中,避光,振荡10分钟；用注射用水洗数次至黄色本底变白；加入新配制的0.2 %AgNO3溶液白炽灯下照射30分钟；水洗五次；显色液500ml中加甲醛0.35ml，待样品蛋白带及分子量蛋白带清晰后弃去显色液加入终止液。225扫描2251打开扫描仪,摘下“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌。2252对胶

12、片进行扫描,同时记录下扫描结果。2253关闭扫描仪,摘下“运行”标志牌,挂“备用”标志牌。226摘下场地“使用中”标志牌,挂“待处理”标志牌。 3 结果判定31判定标准:染色后胶片经扫描仪扫描，样品蛋白带含量应在95%以上，二聚体量不超过5%。32判定结果填写记录。4 清场41需要低温贮存的液体放入冰箱，避光的液体放入阴暗处。42称药之后将药品瓶盖盖紧，放回药品柜。43关闭扭力天平，清洁干净后放回原处，挂“备用”标志牌。44清洁工作台面，用专用抹布擦净，地面用专用拖布拖净。45用过的玻璃器皿用纯化水冲洗干净后返回洗刷组。46填写清场记录。47清场后由车间工序负责人或质量监督员检查合格后,摘下“

13、待处理”标志牌,挂“清场合格”标志牌。5 注意事项51本实验所用SDS需高纯度SDS,如不纯需重结晶。52样品必须经沸水处理3-5分钟,以免有亚稳聚合物存在。 附:SDS-PAGE(快速电泳)准备工作同前。1 制胶11分离胶制备：（13.5%）聚丙烯酰胺凝胶母液7.2ml, 分离胶缓冲液4ml,1%SDS3.2ml，注射用水 1.6ml，1%过硫酸铵0.8ml，1%TEMED0.8ml，制成胶量16ml。12浓缩胶的制备(4.5%)聚丙烯酰胺凝胶母液1.2ml, 浓缩胶缓冲液2ml,注射用水2.4ml，1%SDS0.8ml，1%过硫酸铵0.8ml，1%TEMED0.8ml，pH6.8，成胶量8ml。13灌胶：先