第四章 基因工程的主要技术及其原理

1、基因工程的支撑技术 第四章 基因工程的主要技术及其原理基因工程的主要技术及其原理核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳n琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是琼脂糖是从海藻中

2、提取出来的一种线状高聚物，是由由D半乳糖和半乳糖和3、6脱水脱水L半乳糖结合的链状多半乳糖结合的链状多糖糖 猪基因组猪基因组DNA及及PCR产物产物电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），），6X载载样缓冲液样缓冲液 ： 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液蔗糖水溶液; 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青二甲苯青 ，30%甘油水溶液甘油水溶液实验材料、器具及药品实验材料、器具及药

3、品n相关知识：相关知识：n 影响琼脂糖凝胶影响琼脂糖凝胶DNADNA迁移速迁移速率的因素、迁移速率由率的因素、迁移速率由DNADNA的分的分子大小、琼脂糖浓度、子大小、琼脂糖浓度、DNADNA的构的构象、所加电压、电场方向、碱象、所加电压、电场方向、碱基组成与温度、嵌入染料的存基组成与温度、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等许多在、电泳缓冲液的组成等许多参数确定。参数确定。 表表 琼脂糖浓度与琼脂糖浓度与DNA分离范围分离范围实验步骤n 1g 琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60，加入100l的0.5mg/ml EB，并摇匀。） 用胶带

4、将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。(4) 用移液器吸取总用移液器吸取总DNA或质粒样品或质粒样品4l于点样板于点样板上，再加入上样缓冲液上，再加入上样缓冲液loading buffer，混匀后，混匀后，小心加入点样孔。小心加入点样孔。 打开电源开关，调节电压至打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。 将凝胶放入将凝胶放入EB染液中染色染

5、液中染色5-10min,用清水稍微用清水稍微漂洗。漂洗。 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。条带。实验步骤结果与分析 图2 基因组DNA1%琼脂凝胶电泳图结果与分析 图2 PCR产物琼脂凝胶电泳图 (1、2、3、4为PCR产物，M为DL2000Marker) 实验步骤实验步骤制制 胶胶9090以上熔化，凝胶温度以上熔化，凝胶温度35-43 35-43 1、孔深、孔深 2、预留尺寸、预留尺寸 3、梳子宽度、梳子宽度 1+2= 胶的厚度胶的厚度-+加缓冲液加缓冲

6、液拔梳子拔梳子-+点点 样样-+电电 泳泳DNA空间结构电压 EB脉冲电场（脉冲电场（PFGE） 解决大分子解决大分子DNA电泳问题电泳问题 定义：定义：n印迹法（印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。探测反应来检测样品的一种方法。n1975年，年，Southern建立了将建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，膜）上，并利用并利用DNARNA或者或者DNA-DNA杂交检测特定的杂交检测特定的DNA片段的方法，片段的方法，称为称为Southern印迹法。印迹法。n而

7、后人们用类似的方法，对而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对和蛋白质进行印迹分析，对RNA的的印迹分析称为印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法印迹法 (1) Southern 印迹杂交法印迹杂交法 限制性内切酶酶切 检测杂交信号检测杂交信号 提取提取DNADNA Southern Southern 法可用于法可用于检测特异的检测特异的DNADNA序列片段序列片段, ,进进行基

8、因定位、分子量测定等。行基因定位、分子量测定等。Southern Blot Part I: Gel electrophoresis followed by transfer to a membraneDNA Cleaved with a restriction enzymeSmear of restriction fragments80度烘烤度烘烤1-2hSouthern Blot Part II: Hgybridization of DNA on membrane to specific probeDNA stained with ethidium bromideautoradiograph

9、 of hybridized membraneSouthern BlotNorthern Blot probed with b b-globinUndifferentiated cells+ differentiation factorNote: Make northern just like a Southern, except run out RNA samples rather than DNA Measures the steady-state level of mRNA transcript from a given geneSmear of RNA transcripts 核酸杂交

10、技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来检验核酸的缺失、插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中的关系，其主要应用如下图所示 ：核酸杂交及其应用示意图.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链.突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线框内是已缺失的部分；D是显示从天然DNA链鼓出小泡 .粗线代表探针，粗线上的X表示放射性标记 在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称探针技术(Probe)。 探针技术在遗传性疾病诊断上已开始应用。 例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中

11、提取DNA，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量DNA后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。 杂交和探针技术是许多分子生物学技术的基础，在生物学和医学的研究中，以及临床诊断中得到了日益广泛的应用。Western blot 实验技术实验技术 Making a probenUse the known amino acid sequence of a proteinnSynthesise a short DNA sequence in vitronAA: phe met trp gl

12、u cys asnCodons: UUUC AUG UGG GAAG UGUC AAUCProbe: AAAG TAC ACC CTTC ACAG TTAG -P32A short sequence of a protein is used to design a set of oligonucleotides for use as a probe to recover the gene that encodedthe protein. One of the probe sequence will be a perfect match for thegene Western Blot基本原理

13、在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。n蛋白样品的制备蛋白样品的制备nSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 凝胶电泳凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色 蛋白样品的定量蛋白样品的定量Bradford法法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，

14、该化合物在在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量上样量)试剂：考马斯亮蓝工作液，试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将将10mg/ml蛋蛋白溶液稀释至白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）。）管号管号012345678ddH2O807070707070707070蛋白标准蛋白标准液液01010101010101010样品样品

15、101010101010101010HCL101010101010101010SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳原理： SDS SDS 是一种离子性的界面活性剂是一种离子性的界面活性剂, ,它有强离子性的硫酸根离它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水子也带有疏水性的长碳链性的长碳链. .当当 SDS SDS 与蛋白质混合时与蛋白质混合时, ,它会以其碳链与蛋白它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来基酸结合将蛋白质包起来, ,而以硫酸根离子外露与水分子作而以硫酸根离子外露与水分子作用用. .大多数蛋大多数蛋白质和白质和 SDS SDS 的平均结合量是的平均结合

16、量是 1:1.4 (1:1.4 (以重量为单位以重量为单位),),而蛋而蛋白质结合固定白质结合固定比例之比例之 SDS SDS 後後, ,由於由於 SDS SDS 带强负价带强负价, ,使蛋白质原先的带电价使蛋白质原先的带电价微不足道微不足道, ,且且每单位重量之蛋白质带电价一致每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),(charge density),所以决所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素M丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的配胶的Tris缓冲液缓冲液MTEMEDM过硫酸

17、铵过硫酸铵(时间时间)MTris-甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶浓度（）凝胶浓度（）线性分离范围（线性分离范围（KD)KD)151512-4312-43101016-6816-687.57.536-9436-945.05.057-21257-212转膜半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转润滤纸之间，电转101030min30min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转置的缓冲液中，电转45min45min或过夜。或过夜。 蛋白带出现后，于室温

18、用去离子水漂洗硝酸纤维素滤蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。膜，换水几次。只用于放射性标记抗体或放射性标记只用于放射性标记抗体或放射性标记A A蛋白探针的蛋白探针的WesternWestern印迹过程。印迹过程。 一抗、二抗孵育n把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以以0.1ml/cm20.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。3737一小时，一小时，4 4 过夜。过夜。n倒掉一抗溶液，用倒掉一抗溶液，用PBSPBS漂洗液滤膜漂洗液滤膜3 3次，每次次，

19、每次10min10min。n加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 3737一小时，一小时，4 4 过夜。过夜。n倒掉一抗溶液，用倒掉一抗溶液，用PBSPBS漂洗液滤膜漂洗液滤膜3 3次，每次次，每次10min10min。辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)？ 背景太高膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染封闭不充分封闭不充分抗体与封闭剂出现交抗体与封闭剂出现交叉反应叉反应抗体浓度过高抗体浓度过高 原原原因原因对对策策转膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜完甲醇将膜完全浸湿全浸湿拿取膜与吸水纸时

20、要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度Western blot is similar in concept to northern, except use polyacrylamide and run out proteinsSouthern, Northern, and Western analyses免疫化学检测法免疫化学检测法Using antibodies to detect a clone重组体的转化n利用物理方法导入、

21、转化 1.质粒的质粒的Ca2+诱导转化诱导转化 (E. coli ) 2.质粒的原生质体转化质粒的原生质体转化 3.质粒的高压电穿孔法转化质粒的高压电穿孔法转化 4.显微注射法转化显微注射法转化 n利用生物方法导入、转染1.细胞噬菌体细胞噬菌体DNA的转染的转染2.动物病毒动物病毒DNA的转染的转染3.植物病毒植物病毒DNA的转染的转染大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备在不含抗生素的在不含抗生素的LB平板上涂布大肠杆菌平板上涂布大肠杆菌DH5，于，于37培养培养过夜过夜(16-20h)；挑一个单菌落接种于挑一个单菌落接种于25mL无菌的无菌的LB 培养液中，培养液中， 37中速中

22、速震荡培养震荡培养3h；将上述菌液在冰浴将上述菌液在冰浴5分钟分钟,然后在然后在 4 ,4000rpm 离心离心10分钟分钟;将细菌沉淀用将细菌沉淀用5mL 预冷的预冷的CaCl2（0.1M）重悬，冰浴一会后）重悬，冰浴一会后于于4 4000rpm离心离心10分钟；分钟；将细菌沉淀用将细菌沉淀用1mL 预冷的预冷的CaCl2（0.1M）重悬，取）重悬，取200uL用用于细菌转化于细菌转化,其余菌液加入其余菌液加入20%的无菌甘油的无菌甘油,摇匀后于摇匀后于-20保保存备用存备用; 感受态细胞的转化感受态细胞的转化n（1）取）取2L连接产物，加入连接产物，加入80L感受态细胞，混感受态细胞，混匀

23、，冰上放置匀，冰上放置30min。n（2）将反应管快速转移）将反应管快速转移42水浴中，热击水浴中，热击90s。n（3）将反应管快速转移至冰上）将反应管快速转移至冰上2minn（4）加入）加入500-800 L LB液体培养基。液体培养基。n（5）37，150 rpm复苏复苏1.5 h。n（6）取）取100L菌液涂布于菌液涂布于LB固体培养基上（含固体培养基上（含100g/mL的的Amp）n（7）37下培养下培养16-24 h。Transforming E.coli with recombinant DNAGrowth of Bacteria lPCR的最早设想： 本世纪60年代末、70年代初

24、人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR技术ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术ATCGCGATA

25、GCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术lPCR的改进与完善：Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的一个片段，其缺点是：此酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环都要重新加。PCR技术l其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，此种酶催化的PCR技术虽较传统的基因

26、扩增具备许多突出的优点，但由于酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引生物医学界的足够重视。PCR技术l1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。PCR技术Taq DNA聚合酶的特点：l耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。l在热变性时不会被钝化，不必在每次扩

27、增反应后再加新酶。l大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。PCR技术()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20复温 PCR反应条件PCR过程PCR反应条件PCR过程PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单链子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍PCR技术PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR技术PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95 50引物1引物2DNADNA引物引物PCR技术PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PC