眼针干预脑缺血再灌注模型大鼠神经功能及相关神经营养因子的表达

1、www.CRTER.org刘慧影，等. 眼针干预脑缺血再灌注模型大鼠神经功能及相关神经营养因子的表达眼针干预脑缺血再灌注模型大鼠神经功能及相关神经营养因子的表达刘慧影1，王鹏琴2，边 颖1，王金春1，魏颖鸿1(1沈阳市第五人民医院神经内一科，辽宁省沈阳市 110023；2辽宁中医药大学附属第一医院康复科，辽宁省沈阳市 110032)引用本文：刘慧影，王鹏琴，边颖，王金春，魏颖鸿. 眼针干预脑缺血再灌注模型大鼠神经功能及相关神经营养因子的表达J.中国组织工程研究，2016，20(18): 2634-2641.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.008 OR

2、CID: 0000-0003-3166-3344(刘慧影)文章快速阅读：眼针干预对脑缺血再灌注模型大鼠的神经保护作用刘慧影，女，1982年生，辽宁省沈阳市人，汉族，辽宁中医药大学在读硕士，主治医师，主要从事脑血管病诊疗方法的研究。通讯作者：王鹏琴，博士，主任医师，辽宁中医药大学附属第一医院康复科，辽宁省沈阳市 110032中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)18-02634-08稿件接受：2016-03-16http:/WWW.眼针干预脑缺血再灌注模型大鼠 改善神经功能；缩小脑梗死体积 神经生长因子表达脑源性神经营养因子表达 文题释义：神

3、经生长因子：是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。神经生长因子包含，共3个亚单位，活性区是亚单位，由2个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体，与人体神经生长因子的结构具有高度的同源性，生物效应也无明显的种间特异性。脑源性神经营养因子：是体内含量最多的神经营养因子，它通过与酪氨酸激酶B的结合而发挥作用。酪氨酸激酶B的胞内区域具有内在的酪氨酸激酶活性，脑源性神经营养因子与酪氨酸激酶B结合后激活胞内区域，引起酪氨酸激酶B自身磷

4、酸化作用增强，进而激活Ras-MAPK通路，最后在CAMP反应元件结合蛋白(CREB)的丝氨酸位点激活CREB。CREB通过增加脑源性神经营养因子基因及抗凋亡蛋白基因bcl-2的表达，来促进神经细胞生存，增加突触可塑性及神经发生。摘要背景：眼针疗法主要是针刺眼球周围、眼眶边缘的穴位，调整气血运行、疏经通络和调和阴阳，现已在临床广泛运用，对缺血性脑血管病等多种疾病疗效显著，但是具体作用机制尚不明确。神经营养因子是一类调控神经元存活、发展和发挥作用的蛋白家族，包括神经营养因子和脑源性神经营养因子等。 目的：观察眼针对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织神经生长因子、脑源性神经营养因子表达的影响。方法：将54

5、只雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组、模型组和眼针组，每组18只。后2组采用线栓法制备大脑中动脉闭塞模型，眼针组于缺血2 h后进行眼针干预，于大鼠眶周2 mm处取穴肝区、上焦区、下焦区和肾区。治疗第3，7，14天进行神经功能评分。治疗第1，2周，免疫组织化学染色检测神经生长因子、脑源性神经营养因子阳性表达，治疗第2周采用TTC染色法检测脑梗死体积。结果与结论：眼针组治疗后第1，2周神经生长因子、脑源性神经营养因子阳性表达细胞明显高于模型组(P 0.05)，与治疗后第1周相比，第2周数量下降。治疗后第7，14天眼针组神经功能评分明显降低，与模型组比较差异有显著性意义(P 0.05)，但仍高于假手

6、术组 (P 0.05)；治疗后第2周，眼针组和模型组大鼠脑梗死体积均明显大于假手术组(P 0.01)，但眼针组脑梗死体积明显小于模型组(P 0.05)；结果证实，眼针干预可能是通过增强脑缺血后神经生长因子和脑源性神经3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083营养因子的表达，从而改善神经功能，缩小脑梗死体积，对缺血性脑损伤具有一定的保护作用。关键词：实验动物；神经损伤与修复动物模型；眼针；大脑中动脉闭塞；脑梗死；神经生长因子；脑源性神经营养因子；神经功能；梗死体积；神经营养因子；大鼠主题词：梗塞，大脑中动脉；神经生长因子；脑源性神经营养因子；针刺穴位；眼；

7、组织工程基金资助：辽宁彭氏眼针学术流派传承工作室建设项目(Lpgzs2012-09)Effects of eye acupuncture therapy on neurological function and brain-derived neurotrophic factor expression in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion injuryLiu Hui-ying, Studying for masters degree, Attending physician, First Department of Neurology,

8、Shenyang Fifth Peoples Hospital, Shenyang 110023, Liaoning Province, ChinaCorresponding author: Wang Peng-qin, M.D., Chief physician, Department of Rehabilitation, First Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, ChinaLiu Hui-ying1, Wang Peng

9、-qin2, Bian Ying1, Wang Jin-chun1, Wei Ying-hong1(1First Department of Neurology, Shenyang Fifth Peoples Hospital, Shenyang 110023, Liaoning Province, China; 2Department of Rehabilitation, First Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, Chin

10、a)AbstractBACKGROUND: Eye acupuncture therapy is a technique used to adjust qi-blood circulation, relax muscles and tendons, and activate collaterals by acupuncture at the acupoints around the eye balls and in the orbital border. This therapy has been widely used in the clinic because it exhibits re

11、markable therapeutic effects on many ischemic cerebrovascular diseases. However, the precise mechanism behind this therapy remains poorly understood. Neurotrophic factors are a protein family including neurotrophic factors and brain-derived neurotrophic factors that can regulate neuronal survival, d

12、evelopment and functioning.OBJECTIVE: To investigate the effects of eye acupuncture therapy on neurological function and nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor expression in the brain tissue of rat models of cerebral ischemia/reperfusion injury. METHODS: Fifty-four male Sprague-Da

13、wley rats were randomly divided into three groups with 18 rats per group: sham-operated, model and eye acupuncture therapy groups. Rat models of middle cerebral artery occlusion were established by the intraluminal suture method in the model and eye acupuncture therapy groups. Eye acupuncture was pe

14、rformed at the following acupoints liver area, upper-jiao area, lower-jiao area and kidney area located at the internal orbital margin at 2 hours after cerebral ischemia/reperfusion injury. Rat neurological function was evaluated at 3, 7, and 14 days after injury. Nerve growth factor and brain-deriv

15、ed neurotrophic factor expression in the rat brain tissue was detected using immunohistochemical staining method at 1 and 2 weeks after treatment. Cerebral infarct size was determined using TTC staining at 2 weeks after treatment. RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 1 and 2 weeks after injury, nerve grow

16、th factor and brain-derived neurotrophic factor expression was significantly greater in the eye acupuncture therapy group than in the model group (P 0.05), but nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor expression in the eye acupuncture therapy group was decreased at 2 weeks after inj

17、ury compared to that at 1 week after injury. (2) At 7 and 14 days after treatment, neurological function scores in the eye acupuncture therapy group were significantly lowered, and there was significant difference between eye acupuncture therapy and model groups (P 0.05), but they were significantly

18、 higher than those in the sham-operated group (P 0.05). (3) At 2 weeks after treatment, cerebral infarct size was significantly greater in the eye acupuncture therapy and model groups than in the sham-operated group (P 0.01), and it was significantly smaller in the eye acupuncture therapy group than

19、 in the model group (P 0.05). (4)These results indicate that eye acupuncture therapy shows neuroprotective effects on ischemic cerebral injury by increasing nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor expression, improving neurological function, and reducing cerebral infarct size.Subje

20、ct headings: Infarction, Middle Cerebral Artery; Nerve Growth Factor; Brain-Derived Neurotrophic Factor; Acupuncture Points; Eye; Tissue Engineering Funding: a grant from Liaoning Pengs Eye Acupuncture Therapy Academic Inheritance Studio Construction Project, No. Lpgzs2012-09Cite this article: Liu H

21、Y, Wang PQ, Bian Y, Wang JC, Wei YH. Effects of eye acupuncture therapy on neurological function and brain-derived neurotrophic factor expression in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(18): 2634-2641.2639ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLK

22、HAH0 引言 Introduction脑梗死是由于脑组织缺血、缺氧、坏死而导致动脉狭窄或闭塞，引发一系列神经功能缺失表现。该病具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高以及并发症多等特点，对脑保护和康复治疗已成为国内外学者研究的重点。大量临床研究表明，针灸治疗脑缺血疾病具有较好疗效，对患者语言、运动等功能恢复和并发症的改善均有良好的促进作用1-3，其中眼针疗法是一种特殊针灸施术针法，由辽宁中医药大学附属医院著名老中医彭静山教授于20世纪70年代首创，主要是针刺眼球周围、眼眶边缘的穴位，调整气血运行、疏经通络和调和阴阳，现已在临床广泛运用，对缺血性脑血管病等多种疾病疗效显著4-5，但是具体作用

23、机制尚不明确。神经营养因子是一类调控神经元存活、发展和发挥作用的蛋白家族，包括神经营养因子3、神经营养因子6、神经生长因子(never growth factor，NGF)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)等，均与神经系统疾病关系密切6-8。神经生长因子是神经系统非常重要的生物活性分子之一，对调节神经元的生长、发育、分化、存活及损伤神经的再生修复具有重要作用。王刚等9对周围神经损伤患者进行一期神经修复同时利用自制的梯度缓释系统进行神经生长因子局部缓释，经神经电生理检查和感觉及运动功能评定，表明神经生长因子梯度缓释系统可早期安全、

24、有效地促进周围神经损伤修复后的功能恢复。脑源性神经营养因子是一种小分子二聚体蛋白质，在结构上与神经生长因子相关，对中枢神经系统的多种类型神经元的生长、发育、分化、维护和再生同样具有重要作用。赵淑杰等10研究表明脑源性神经营养因子能改善6-羟多巴胺所致的帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元数目的减少，明显抑制6-羟多巴胺引起的纹状体部多巴胺含量降低，并可抑制6-羟多巴胺对黑质多巴胺能神经元的毒性作用。实验选择不同时间段观察眼针对脑缺血再灌注模型大鼠神经功能和脑组织神经生长因子、脑源性神经营养因子表达的影响，探索其可能的作用机制。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计

25、随机对照动物实验。1.2 时间及地点 于2014年5至7月在辽宁中医药大学实验室完成。1.3 材料 SPF级健康SD大鼠54只，雄性，体质量180-220 g，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。自由饮水、普遍颗粒饲料喂养，光暗周期12 h，室内温度18-22 ，相对湿度55%-70%。实验对动物处置严格遵循动物伦理学要求。适应性喂养1周后，将大鼠54只随机分为假手术组、模型组和眼针组，每组18只大鼠。1.4 实验方法1.4.1 脑缺血再灌注模型大鼠的制备 参照改良Longa线栓法制备大脑中动脉栓塞模型11。主要步骤为：10%的水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，常规消毒，取颈正中切口，分

26、离右侧颈总动脉，颈外动脉与颈内动脉，结扎颈总动脉近心端及颈外动脉，将预先处理过的4-0尼龙线的线栓插入颈总动脉，经颈内动脉送至颅内，稍遇阻力则止，线栓插入深度距离颈内、外分叉处18-20 mm(注意鱼线不能插入过深，否则易致蛛网膜下腔出血)，收紧线栓。缝合切口，留置线头于体外，用手术灯照射，2 h后实现再灌注时，抽提线栓至颈总动脉内即可。假手术组只分离出右颈内、外动脉，不结扎、不插尼龙线。造模后的动物在自然苏醒后，若出现追尾现象、原地向左侧旋转、右侧出现Honer征为造模成功。1.4.2 眼针干预 眼针组大鼠缺血2 h再灌注即刻给予眼针干预。大鼠皮肤用体积分数为75%的乙醇棉球消毒后，取31号

27、13 mm毫针，于大鼠眶周2 mm处针刺，定位参照人体取穴12，取穴肝区、上焦区、下焦区和肾区。采取眶外平刺法平刺进针，左眼按照顺时针方向(右侧按逆时针方向)刺入真皮，达到皮下组织，进针3 mm终止。留针20 min，留针10 min时用刮柄进行刮针1次，每针5下，拔针后用干棉球按压针眼防止出血。1.4.3 神经功能评估 于治疗后第3，7，14天参照Longa方法11进行神经功能评分。0分：无明显神经缺损症状；1分：不能完全伸展前爪；2分：行走时，身体向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自行行走，意识消失。1.4.4 免疫组织化学染色 于治疗后第1周和第2周，3组每个时间点取6只大鼠

28、，将大鼠用体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速打开胸腔暴露心脏，经左心室先灌流生理盐水100 mL，然后灌流40 g/L多聚甲醛进行固定30 min，断头取脑，放入40 g/L多聚甲醛固定过夜，组织脱水、透明、浸蜡、包埋，以梗死灶为中心行连续冠评价指标：(1)治疗第3，7，14天参照Longa方法进行神经功能评分(2)治疗第1周和第2周免疫组织化学染色检测神经生长因子、脑源性神经营养因子的表达(3)治疗第2周TTC染色法计算脑梗死体积验证：眼针干预可能通过增强脑缺血后神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达，从而改善神经功能，缩小脑梗死体积，对缺血性脑损伤具有一定的保护作用眼针组18只采用改

29、良Longa线栓法造模采用改良Longa线栓法造模，缺血2 h再灌注即刻给予眼针干预模型组18只只分离出右颈内、外动脉，不结扎、不插尼龙线假手术组18只SD大鼠54只图1 干预流程图Figure 1 Flow chart of experimental intervention状切片(片厚7 m)，每只大鼠取2张连续切片，分别进行神经生长因子、脑源性神经营养因子免疫组化染色。具体操作步骤：切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，滴加体积分数3%H2O2室温下放置10 min，PBS漂洗3次，每次5 min；然后滴加体积分数5%BSA室温封闭 15 min，分别滴加一抗兔抗鼠神经生长因子抗体、兔抗鼠脑源

30、性神经营养因子抗体 (1200)，4 过夜，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加生物素标记的二抗，室温孵育20 min，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加SABC试剂，室温孵育20 min，PBS漂洗3次，每次5 min；DAB显色，PBS漂洗3次，苏木精复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。以PBS代替一抗作为空白对照，进行上述免疫组织化学染色。光学显微镜(日本Olympus公司)下观察神经生长因子、脑源性神经营养因子阳性表达细胞呈棕黄色，每张切片选择3个相邻视野计数染色明显的阳性细胞，并用全自动图像分析系统对染色强度进行定量分析，测定灰度值。1.4.5 TTC染色法计算脑梗死体积

31、 于治疗后第2周， 3组各取6只大鼠，将大鼠用体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速断头取脑组织，制作冠状位切片，厚 2 mm，立即置于体积分数2%的TTC溶液中，于37 下染色30 min，40 g/L多聚甲醛固定30 min。采用显微图像分析系统采集图像，其中正常脑组织染成红色，梗死灶为白色，计算大鼠脑梗死体积百分比。1.5 主要观察指标 各组大鼠神经功能评分。各组大鼠脑组织神经生长因子、脑源性神经营养因子阳性细胞数量和胞质平均灰度值。各组大鼠脑梗死体积百分比。1.6 统计学分析 计量资料采用s表示，采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析，多组间数据差异的比较采用单因素方差分析和

32、SNK-q 检验，P 0.05)；模型组与眼针组神经功能评分均明显高于假手术组 (P 0.05)；治疗后第7，14天眼针组神经功能评分明显降低，与模型组比较差异有显著性意义(P 0.05)，但仍高于假手术组(P 0.05)，说明眼针干预可明显改善脑缺血再灌注模型大鼠的神经功能，见图2。2.3 大鼠脑组织神经生长因子的表达 免疫组织化学染色观察显示，神经生长因子阳性表达的细胞胞浆染成棕黄色，假手术组只观察到少量的神经生长因子阳性细胞。模型组神经生长因子阳性细胞数量增多，免疫阳性细胞平均灰度值降低，与假手术组比较差异有显著性意义(P 0.05)；模型组第2周时间点与第1周时间点相比，神经生长因子阳

33、性细胞数量减少(P 0.05)，免疫阳性细胞平均灰度值增高(P 0.05)。眼针组第1周时间点神经生长因子阳性细胞数量明显增多，免疫阳性细胞平均灰度值明显降低，与模型组和假手术组比较差异有显著性意义(P 0.05)；眼针组FEDCBA图3 各组大鼠脑组织皮质部位神经生长因子的表达(免疫组织化学染色，20)Figure 3 Nerve growth factor expression in rat cerebral cortex in each group (immunohistochemistry, 20)图注：图中A，B为假手术组治疗后第1，2周，只观察到少量的神经生长因子阳性细胞；C，D为

34、模型组治疗后第1，2周，神经生长因子阳性细胞数量增多，与治疗后第1周相比，第2周数量下降；E，F为眼针组治疗后第1，2周，神经生长因子阳性细胞数量明显多于其他2组，第2周神经生长因子阳性细胞数量有所下降，但仍多于同时间点的模型组。CBAFED图4 各组大鼠脑组织皮质部位脑源性神经营养因子的表达(免疫组织化学染色，20)Figure 4 Brain-derived neurotrophic factor expression in rat cerebral cortex in each group (immunohistochemistry, 20)图注：图中A，B为假手术组治疗后第1，2周，只

35、观察到少量的脑源性神经营养因子阳性细胞；C，D为模型组治疗后第1，2周，脑源性神经营养因子阳性细胞数量增多，第1周与第2周相比无显著性差异；E，F为眼针组治疗后第1，2周，脑源性神经营养因子阳性细胞数量明显多于其他2组，治疗后第2周脑源性神经营养因子阳性细胞数量有所下降，但仍多于同时间点的模型组。眼针组模型组假手术组3.02.52.01.51.00.50aaaaaabaab神经功能评分0 d 3 d 7 d 14 d图2 各组不同时间点神经功能评分变化Figure 2 Neurological function score in each group at different time poi

36、nts图注：与假手术组比较，aP 0.01；与模型组比较，bP 0.05。第2周时间点神经生长因子阳性细胞数量有所下降，但仍高于同时间点的模型组(P 0.05)，免疫阳性细胞平均灰度值低于模型组(P 0.05)，表明眼针刺激能明显增强脑缺血再灌注模型大鼠脑组织神经生长因子的表达，见表1和图3。2.4 免疫组织化学染色观察大鼠脑组织脑源性神经营养因子的表达 脑源性神经营养因子与神经生长因子表达规律相仿，主要分布在脑梗死灶周围皮质和海马区，脑源性神经营养因子阳性表达的细胞胞浆和胞膜染成棕黄色，假手术组只观察到少量的脑源性神经营养因子阳性细胞，染色强度较弱。模型组第1周和第2周时间点脑源性神经营养因

37、子阳性细胞数量比假手术组明显增多，免疫阳性细胞平均灰度值明显降低，差异有显著性意义(P 0.05)。眼针组第1周时间点脑源性神经营养因子阳性细胞数量明显增多，免疫阳性细胞平均灰度值明显降低，与模型组和假手术组比较差异有显著性意义(P 0.05)；与第1周比较，眼针组第2周时间点脑源性神经营养因子阳性细胞数量有所下降(P 0.05)，但仍高于同时间点的模型组(P 0.05)，免疫阳性细胞平均灰度值低于模型组(P 0.05)，表明眼针刺激能明显增强脑缺血再灌表1 眼针对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织神经生长因子表达的影响 (s，n=6)Table 1 Effects of eye acupunctur

38、e therapy on nerve growth factor expression in rat brain tissue after cerebral ischemia/reperfusion injury组别治疗后第1周治疗后第2周20倍视野下阳性细胞数(个)灰度值20倍视野下阳性细胞数(个)灰度值假手术组3.541.09168.585.123.441.08173.116.36模型组19.862.37a145.553.98a13.082.26ab160.224.31ab眼针组37.683.48ac126.503.24ac25.813.25abc146.733.60abc表注：与假手术组

39、比较，aP 0.05；与第1周比较，bP 0.05；与模型组比较，cP 0.05。组别治疗后第1周治疗后第2周20倍视野下阳性细胞数(个)灰度值20倍视野下阳性细胞数(个)灰度值假手术组3.260.58134.525.342.940.45136.666.63模型组19.622.77a120.314.95a17.822.54a123.395.01a眼针组28.023.08ac107.094.28ac22.162.68abc118.364.60abc表注：与假手术组比较，aP 0.05；与第1周比较，bP 0.05；与模型组比较，cP 0.05。表2 眼针对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织脑源性神经营养

40、因子表达的影响 (s，n=6)Table 2 Effects of eye acupuncture therapy on brain-derived neurotrophic factor expression in rat brain tissue after cerebral ischemia/reperfusion injury表3 眼针对脑缺血再灌注模型大鼠脑梗死体积的影响(s，n=6)Table 3 Effects of eye acupuncture therapy on cerebral infarct size in rat models of cerebral ischemi

41、a/reperfusion injury 表注：与假手术组比较，aP 0.01；与模型组比较，bP 0.05。组别梗死体积(mm3)脑梗死体积(%)假手术组00模型组59.753.07a14.864.65a眼针组22.323.85ab9.632.42ab注模型大鼠脑组织脑源性神经营养因子的表达，见表2和图4。2.5 各组大鼠脑梗死体积百分比 模型组大鼠大脑切片梗死区呈白色，眼针组大鼠脑片梗死区白色部分明显缩小。治疗后第2周，眼针组和模型组大鼠脑梗死体积均明显大于假手术组(P 0.01)，但眼针组脑梗死体积明显小于模型组(P 0.05)，见表3。3 讨论 Discussion眼针疗法属于微针中的

42、一种疗法，主要以脏腑经络学说，五轮八廓学说以及易经的阴阳八卦学说为理论根据，通过针刺眼眶周围的穴区以调整气血运行、疏经通络和调和阴阳，长期以来已在临床得到广泛应用，其中应用最多的是脑血管疾病13-14，也就是中医所说的“中风”， 其基础病变在血脉，“脉者，血之府也”，脉以通为顺，若血运不利，瘀血在脑，即引起缺血等症状，其他疾病还有头痛、胃痛、急性扭伤和痛经等15-17。眼针的操作手法不同于其他针灸手法，快速刺入以后，不用提插、捻转、开合任何手法，针刺后患者即有麻酸胀痛或温热、清凉等感觉，具有操作简便，有效率高等特点。大量研究证实眼针治疗脑血管疾病有显著效果18-19，实验对脑缺血再灌注模型大鼠

43、进行眼针干预，结果显示治疗后第7，14天眼针组神经功能评分明显降低，与模型组比较差异有显著性意义；治疗后第2周，眼针组和模型组大鼠脑梗死体积均明显大于假手术组，但眼针组脑梗死体积明显小于模型组，说明眼针干预可明显改善脑缺血再灌注模型大鼠的神经功能，缩小梗死体积，但其作用机制尚未完全阐明。神经生长因子是神经营养因子家族中重要的成员之一，是近年来引起科学家们十分关注的特异蛋白质分子，其与中枢神经系统疾病的关系日益受到重视。神经生长因子在脑内含量较少，主要存在于海马、大脑皮质和嗅球等部位，研究证实其能够促进受损神经元的存活和再生，从而改善神经功能、运动功能等相应症状20-23。刘鹏等24研究表明脑缺

44、血大鼠的神经功能评分和梗死体积均严重受损，缺血半暗带神经生长因子、脑源性神经营养因子阳性神经元数增加，结果表明脑缺血可上调缺血半暗带神经生长因子、脑源性神经营养因子的表达水平。实验结果显示，模型组在第1周后脑组织神经生长因子阳性表达明显多于假手术组，在治疗后第2周时神经生长因子表达虽有所下降，但仍高于假手术组，可能是造模后脑组织启动了内源性保护机制，上调脑内神经营养因子的表达，从而降低缺血对脑组织的损害，挽留更多的脑功能25。单纯内源性神经生长因子的上调不足以防止神经细胞死亡，只有当达到一定阈值损伤神经元才能够恢复，眼针组在治疗后第1周脑组织神经生长因子阳性表达高于模型组和假手术组，在治疗后第

45、2周虽已呈下降趋势，但仍高于同时间点的模型组，提示眼针能提高脑缺血再灌注模型大鼠脑组织神经生长因子的分泌，延长表达时程，是其促进神经功能恢复的机制之一。脑源性神经营养因子也是神经营养因子家族重要成员之一，是1982年Barde等从猪脑中分离纯化出的一种蛋白质，其能够抑制神经元细胞凋亡，促进神经元损伤的修复和再生26-31，在脑中主要分布于皮质、海马、基底节等区域。实验发现，模型组治疗后第1，2周大鼠脑组织脑源性神经营养因子表达明显高于假手术组，可能是因为脑栓塞后机体启动自我保护功能，模型组治疗后2个时间点之间比较差异无显著性意义。眼针组大鼠脑组织脑源性神经营养因子表达显著增多，在2周时仍明显高

46、于模型组，提示眼针治疗效果持续时间较长，作用更持久，眼针疗法可使脑源性神经营养因子持续高水平表达，能有效地修复受损伤神经元，与其他学者研究结果一致32-34。综上所述，眼针干预可能是通过增强脑缺血后神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达，从而改善神经功能，缩小脑梗死体积，对缺血性脑损伤具有一定的保护作用。因为实验只选取2个时间点，所以无法看出神经生长因子和脑源性神经营养因子在脑缺血再灌注模型大鼠缺血区脑组织的表达规律，具体作用环节有待进一步研究。作者贡献：实验设计为王鹏琴。实验实施为刘慧影，实验评估为王金春和魏颖鸿。资料收集为刘慧影和边颖。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题

47、：实验过程中对动物的处置符合2009 年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Che J, Piao LH, Tian

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