分子生物学实验课件：10蛋白质的纯化

1、实 验 十蛋白质的纯化背景理论知识Section 110.1.1 实 验 目 的掌握蛋白质纯化的原理学习Ni-亲和层析纯化蛋白质的方法了解影响蛋白质纯化的各种因素蛋白质的纯化方法（一）根据蛋白质溶解度不同1、蛋白质的盐析2、等电点沉淀法 3、低温有机溶剂沉淀法 （二）根据蛋白质分子大小的差别1、透析与超滤 2、凝胶过滤层析（三）根据蛋白质带电性质1、电泳法2、离子交换层析（四）根据特异性相互作用1、亲和层析2、疏水相互作用层析 10.1.2层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差

2、异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。 10.1.3 层 析 技 术基质/基架：可以偶联配基的惰性材料，如Sepharose, Agarose, Copto间隔臂：减少空间位阻效应，大大增加配基对待分离的生物大分子的吸附效率配基：和目标物有特异性相互作用的物质偶联：将配基与基架以共价键的方式连接10.1.4 亲和层析的原理亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。亲和层析的流程1. 平衡：用结合

3、缓冲液平衡亲和填料。2. 上样和清洗：目标蛋白特异地，但可逆的和配基结合，未结合的物质从柱上清洗下来。3. 洗脱：改变洗脱条件，目标蛋白被洗脱，并收集。4. 再平衡：再用结合缓冲液平衡亲和填料。10.1.5 带有亲和标签的蛋白架10.1.6 His标签和Ni-填料能够完成一般方法很难完成的分离特异相互作用，一步纯化可以达到90%以上的纯度快速将目标蛋白与大量的杂质分离操作简单，可有效保持蛋白活性10.1.7 亲和层析的特点10.1.8 蛋白纯化的影响因素实验操作Section 210.2.1 试剂的配置 Lysis Buffer: 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 用NaOH

4、调pH至8.0。 Wash Buffer: 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM咪唑, 用NaOH调pH至8.0。 Elution Buffer:50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM咪唑,用NaOH调pH至8.0。 100mM PMSF：称取17.4mg PMSF溶于1mL异丙醇，20保存。PMSF在水溶液中易失活，温度越高，失活越快。 溶菌酶（10mg/mL）：使用前用Lysis Buffer （pH8.0）即刻溶解溶菌酶，配制成10mg/mL浓度的贮存液，配制时要确保Lysis Buffer的pH值为8.0，如果溶液的pH值低于8.0则溶菌

5、酶不能有效地工作。 DNase (1mg/mL)：用1mL下述溶液（10mmol/L Tris-Cl pH7.5，150mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2) 溶解2mg DNase ，在DNase 溶解后，加入1mL甘油，盖紧管口轻轻颠倒几次，加以混合。避免产生气泡和泡沫。分装后保存于20。 10.2.2 实验步骤一、收集菌体（已完成）1. 取10mL IPTG诱导3小时的细菌培养液至一支15mL离心管中，平衡，5000g 离心5min，弃上清。2. 用1mL Lysis Buffer将菌体重悬，转移至一个1.5mL EP管中，12000rpm离心1min，弃上清。将菌体沉淀

6、置20冰箱保存。二、裂解细胞1. 将上次保存的菌体取出，室温解冻后加入613uL Lysis Buffer，7uL PMSF（100mM），重悬。2. 向重悬液中加入70uL 溶菌酶（10mg/mL）、7uL RNase A（1mg/mL） 、3.5uL DNase （1mg/mL） ，轻轻混匀后30孵育15min，其间每隔半分钟轻轻摇动一次混合液。3. 15000g离心10min，将裂解上清转移至另一离心管中。10.2.2 实验步骤三、蛋白纯化1. 向裂解上清中加入 Ni-IDA Resin悬液100uL（注意：吸取前充分混匀），轻柔混匀，冰上放置30min，其间每1min轻轻颠倒一次。2. 将裂解上清与Ni-IDA Resin的混合液转移至一个废旧的DNA吸附柱中。3. 500g “short”离心10s，弃流穿液。4. 向柱中加入600uL Wash Buffer，500g “short”离心10s，弃流穿液。5. 重复第“4”步两次。6. 将吸附柱放在一个干净的1.5mL EP管上，向柱中的Resin加入50uL Elution Buffer，静置2min。500g “short”离心10s。7. 将流穿液重新吸回至吸附柱，重复洗脱2次。可在紫外灯下观察洗脱效果。8. 将吸附柱及Resin交回给老师，洗脱下来的蛋白做好标记保存在20 。实验关键点注意低温操作。选择合