南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白EGFP的基因克隆

1、-. z.绿色荧光蛋白EGFP的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进展酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5 (克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆实验日期2015- 2015-实验地点合作者指导教师评分教师签名批改日期实验目的学习使用限制性切酶进展DNA酶切的原理和方法。学习掌握琼脂糖凝胶电泳的根本原理

2、和操作方法。掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。学习PCR产物的TA克隆的根本原理和操作步骤。了解和掌握大肠杆菌的制备方法的根本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。掌握双酶切法鉴定重组DNA的根本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的根本原理和方法。掌握IPTG诱导GFP基因表达的根本原理和操作步骤实验原理pEGFP-N1质粒T载体材料与方法：实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：FGGCATATGGTGAGCAAGGGCGARCGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体pMD18-

3、T vector cloning kit快速DNA连接试剂盒限制性切酶：EcoR IFermentasA*ygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)*-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等方法别离目的基因限制酶切割目的基因与载体连接重组体转入受体细胞筛选重组体、转化子实验具体流程获取外源基因碱裂解法提取质粒使用A*ygen质粒提取试剂盒彻底弃上清弃上清菌液离心1300r pm,1min瞬时离心加350l

4、溶液S3加250l 溶液S2加250l 溶液S1漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀取上清600l加到吸附柱中离心13000rpm,10min颠倒数次离心放置3-5min13000rpm,1min弃滤液，参加600l洗涤液W弃滤液，参加600l洗涤液W离心离心放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加40l洗脱液13000rpm,1min 13000rpm,1minPCR扩增 / -20保存备用弃滤液空柱离心离心13000rpm,2min13000rpm,1minPCR扩增目的基因GFP取0.2 ml PCR反响管一支，用微量加样枪按下述顺序分别参加各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O6l质粒DN

5、ApEGFP-N12l引物GFP1 (10M)1l引物GFP2 (10M)1lPremi* Taq10l总体积20l加完试剂后，将PCR反响管放到PCR仪上。PCE参数设置： 94预变性5分钟后开场以下循环 94 30 秒 56 30 秒 30 循环 72 1 分钟 72 7 分钟 4 保温琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒凝胶准备胶床准备铺胶静置胶床置于电泳槽中加电泳缓冲液拔梳子上样1lPCR产物，6l loading buffer混合点样点marker电泳取出凝胶拍照构建重组DNA使用即用型蓝白T载体和快速DNA连接试剂盒。按下表参加试剂：为了检验转化是否成功，设置对照组实验实验组对照组即用型

6、蓝白T载体1 l1 lPCR扩增产物1 lControl Insert DNA1 l快速连接缓冲液(2*)5 l5 l超纯水-ddH2O2.5 l2.5 lRapid T4 DNA ligase0.5 l0.5 l总体积10 l10 l添加完成后，冰箱16反响45分钟重组DNA的转化预先制备好感受态细胞。转化DNA，为了检验转化是否成功，设置对照组实验实验组：10l PCR产物/蓝白T载体连接产物+ 100l感受态细胞阳性对照组：10l Control Insert DNA/蓝白T载体连接产物+100l感受态细胞阴性对照组：10l无菌双蒸水 + 100l感受态细胞步骤：分别制作3组将10lDN

7、A和100l的感受态细胞参加试管中冰浴30min42水浴准确90s迅速转移至冰浴冷却1-2min参加800lLB培养基恒温培养箱中37培养45min检测重组DNA：涂布平板筛选步骤：取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素Amp、*-gal、IPTG的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟，倒置平皿37培养过夜。重组DNA的筛选培养的菌落在筛选培养基中，白色的菌落含有重组体pUC18，蓝色菌落则没有或只有载体pUC18。挑选白色单菌落扩大培养：用接种棒在白色单菌落上挑取菌落，接种于4mlLB/Amp+培养液中，37震荡培养过夜。重组DNA的鉴定从扩大培养的菌液中提取重组质粒D

8、NA，再进展限制性切酶酶切，经行琼脂糖凝胶水平电泳。进展对照实验。剧烈震荡菌体沉淀扩大培养的菌液步骤：12000rpm250l250l取600l上清于吸附柱管1min溶液S1裂解液S2颠倒混匀4-6次350l温和的颠倒混匀6-8次12000rmp室温静置35min中和液S3直到出现白色絮状沉淀10min弃滤液空柱弃滤液弃滤液 12000rmp600l洗涤液W600l洗涤液W30s12000rpm 30s12000rpm 30s收集洗脱液备用取吸附柱至另一新EP管 10000rpm50l室温静置 12000rpm2 min洗脱液1min1min干净离心管2l10 Buffer R10LH2O6l

9、取5l加1lloading buffer混合取5l，加1lloading buffer混合混合后37水浴116h 2lEcoR I电泳五、结果与讨论：最后插入质粒中的DNA片段应为740bp，重组质粒大小应为3038bp+740bp=3778bp实验结果现象与讨论碱裂法提取质粒5000pEGFP-N1质粒大小为4.7kb，电泳显示光带与marker5k相近，说明质粒提取较成功。电泳显示出两条带，可能原因：参加S2时颠倒力度过大造成DNA断裂。参加S2变形时间过长。参加S3复性时间过长。提取的质粒不够纯洁。PCR扩增目的基因7502000只出现两条带，其中有接近750bp的光带，说明目的基因在PCR扩增中得到扩增。重组DNA的筛选12111111111实验组培养基中：1是蓝色菌落2是白色菌落阳性对照组培养基中只有白色菌落阴性对照组培养基中无菌落说明重组DNA较为成功。5000重组DNA的鉴定2000121是酶切DNA2是提取的质粒DNA当天实验使用的marker为2000bp。5000两个光带均亮度微弱，且均大于2000bp，酶切DNA没有出现740bp的光带。111总结：在PCR扩增中，虽然有接近750bp的光带，但亮度微弱，说明在实验过程中，DNA破坏严重，所以到后面实验中，重组成功的细菌，量不多，光带亮度都微弱。而在实验