Miseq操作流程及报价须知

1、一、最简单快速到建库方法为研究者提供了最简单快速到建库方法，使用转座子酶技术，在试管内即可完成片段化，不需要物理剪切或者酶切步骤，一步完成片段化,末端补平和加接头步骤，整个操作流程只需要90分钟，手动操作步骤不超过20分钟，起始只需要。整合的高度自动化的系统，点击触摸屏即可开展测序提供了最简单的新一代测序流程。通过直观的触摸屏界面开展简单的仪器操作，即插即用的试剂带有追踪，具有自动化的便利。小巧、一体化的平台整合了簇生成，边和成边测序和完整的数据分析，不再需要其他辅助性设备。整个簇生成和测序过程手动操作不超过20分钟。经验证的数据质量以久经考验的边合成边测序技术为基础，通过专利的可逆终止法对数

2、百万个片段进行大规模并行测序，在单个碱基掺入增长链时检测它们。由于每个检测循环中四种可逆终止子结合的都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化，与其他技术相比大大降低了原始错误率。最终结果是高度准确的每个碱基的测序信息，即使是重复序列区和同聚物都确保了可靠的碱基检出。文库构建：剪切，加接头、整合的高度自动化的系统，点击触摸屏即可开展测序Miseq提供了最简单的新一代测序流程。通过直观的触摸屏界面开展简单的仪器操作，即插即用的试剂带有RFID追踪，具有自动化的便利。小巧、一体化的Miseq平台整合了簇生成，边和成边测序和完整的数据分析，不再需要其他辅助性设备。整个簇生成和测序过程手动操作不超过20分钟

3、。三、经验证的数据质量以Illumina久经考验的边合成边测序技术为基础，通过专利的可逆终止法对数百万个片段进行大规模并行测序，在单个碱基掺入增长DNA链时检测它们。由于每个检测循环中四种可逆终止子结合的dNTP都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化，与其他技术相比大大降低了原始错误率。最终结果是高度准确的每个碱基的测序信息，即使是重复序列区和同聚物都确保了可靠的碱基检出。对于不同测序长度、不同测序样本量的最佳测序方案比较高通量测序服务二代测序服务扩增子测序测序对于不同测序长度、不同测序样本量的最佳测序方案比较根据对于单个样本所需检测的基因范围分三档测序范围=100Kb，推荐用Sanger法测序

4、500Kb=测序范围100Kb，推荐用扩增子法测序200Kb测序范围=100Mb，推荐用目标区域捕获测序根据上面的分法，经济比较Sanger法测序，适用范围：测序范围长度=100Kb用传统sanger法测序，每500bp测一对来回，每个测序20元（PCR+sanger测序）。每个样本的测序成本：100000/500*20=4000元/样本。数据分析，500元/样本再加一点人工，总成本4500元/样本以内就完成了。是优势选择。用高通量测序，建库2000元/样本，再加测序的上机费10003000元/样本，还有二代测序必须的生物信息分析费，成本上不占优势。高通量测序在此的唯一的优势，是可以在一个试管

5、中完成PCR，减少起始样本（DNA）用量扩增子+二代测序，适用范围：500Kb=测序范围长度100Kb用扩增子（Amplicon）法测序1.以200Kb，100样本为例2引物及PCR，设计多重PCR引物，每个扩增子约150Bp的长度，总120000元，分摊到每样本，1200元PCR反应，成本20元/样本建库，2000元/样本测序，a.Miseq平台，5G数据/run,26500元/runb.如果一次跑一个run,测24个样本，每个样本的测序部分的成本：26500/24=1104元/样本c.如果一次跑超过24个样本，测序成本可以进一步分摊数据分析，500元/样本总成本：1200+20+2000+

6、1104+500=4824元数据的覆盖深度：Miseq平台，PE2*250测序模式总共5G数据/Flowcell，分到24个样本，最多可到96个样本被测范围，200Kb覆盖深度，5,000,000,000/24/200,000=1041倍覆盖；如果是96个样本，5,000,000,000/96/200,000=260倍PGM平台a.314芯片（也可以选用316/318等芯片，只有通量差别，没有质量差别）分到4个样本每个314芯片的数据产量0.1G被测范围200Kbe.覆盖深度，100,000,000/4/200,000=125倍扩增子测序是100Kb500Kb测序长度范围内的优势选择用sang

7、er法测序，200000/500*2*30=24000，成本过高，不可行用捕获测序，约50006000元，较贵，且操作复杂，分析也复杂，扩增子测序的限制因素：扩增子测序前一步要做多重PCR,到目前为止，多重PCR扩增效率的一致性一直是大难题。扩增子越多，不均一性越高。这使用大于500Kb的范围的测序，很难用扩增子测序的方法做好。c.目标区域捕获法测序，适用范围：100Kb测序范围=100Mb用捕获法测序采购捕获试剂盒，Nimblegen的SeqCapEZChoiceLibrary,96Reaction，USD30000折合含25%税的每反应人民价格：30000*6.2*1.25/96=2421

8、元/反应建库，捕获反应建库，2000元/样本捕获操作，3000元/样本测序，Hiseq2500RapidPE150测序（临床样本追求速度，Rapid快，只用2天测序，比Hiseq2000highthroughputPE100的11天更合适），每个Flowcell,75GPFdata一次每个样本测2GPFdata一个Flowcell，24个样本，因为样本之间在测序过程中的相互竞争，所以上样按每个样本3G上样，这样可以保证大部的样本可以得到2G以上的数据。24*3=72G测序深度，假设捕获区间为7M,捕获的效率为65%（有35%为非特异的片段），2,000,000,000*0.65/7,000,000=185倍，符合绝大多数的检测需求测序成本，每个Hiseq2500rapidPE100flowcell，8万元,分摊到24个样本，80000/24=3333元/样本数据分析a.假设：2000元/样本总成本a.总成本：捕获试剂+建库+捕获操作+测序+数据分析=2421+2000+3000+3333+2000=12754元/样本捕获测序是优势选择扩增子测序，因为其测序所需的多重PCR的中的扩增子过多，所以不可行。并且Miseq或PGM的数据产量也不能很好地覆盖被测